目的心力衰竭作为各种心脏病发展的最后阶段,具有预后差,住院率高,死亡率高等特点。我国已进入老年化社会,心衰患病率已达1.3%。未来几十年内,心衰患者将急速增长,现已成为全世界关注的问题。心脏是人体内最大的耗能器官,线粒体是能量的主要来源。线粒体功能的稳定对于心脏正常生理功能的维持尤为重要。心衰时细胞内线粒体结构发生改变,呼吸链酶的活性增强及功能下降,能量代谢下降和氧化应激增加,线粒体膜转换孔的开放促进细胞凋亡和心肌重构。实验室前期研究发现Liguzinediol(LZDO)可增强心衰大鼠的心肌收缩能力,其是否与线粒体有关?本研究通过大鼠冠状动脉结扎建立心肌梗死诱导的慢性心力衰竭模型,观察Liguzinediol(LZDO)对慢性心衰大鼠心脏功能的影响,明确其是否通过改善心肌细胞的线粒体的功能实现其改善心功能的效应,旨在为LZDO临床治疗心衰提供理论依据。方法1.慢性心衰大鼠模型复制及LZDO的干预利用结扎冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)方法复制心肌梗死诱发的充血性心力衰竭模型。将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,阳性药曲美他嗪(Trimetazidine,TMZ)(10mg/kg)组,LZDO 低、中、高剂量(5、10、20 mg/kg)组,每组10只。给药8周后检测各组大鼠超声心动图,记录血流动力学,观察LZDO对左心室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒张末期压(Left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左室内压最大上升速率(maximum left ventricular pressure rise rate,+dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(maximum left ventricular pressure fall rate,-dp/dtmax)、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastole blood Pressure,DBP)和平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)等指标的影响。称取全心重量(heart mass,HM)和左心室(包含室间隔)的重量(Left ventricular mass,LVM),计算心脏质量指数(heart mass index,HMI)和左心室质量指数(Left ventricular mass index,LVMI)。通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE染色)、马松(Masson)染色观察LZDO对心衰大鼠心肌组织形态学的影响,检测LZDO对心肌损伤标志物如脑钠肽(Brain natriuretic Peptide,BNP)、大鼠肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和肌钙蛋白(Cardiac Troponin I,cTn I)。2.LZDO对慢性心衰大鼠心肌细胞内线粒体的影响试剂盒检测心肌组织中超氧化岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的表达,观察LZDO对心衰大鼠线粒体抗氧化能力的影响;Tunel法检测大鼠心肌组织凋亡、Western blot检测心肌组织凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2 关联 X 蛋白(BCL2-associated X protein,Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Cysteine protease 3,Caspase3)观察LDZO对心肌细胞凋亡的影响;Western blot检测心肌组织线粒体融合线粒体融合素1(Mitofusin 1,MFN1)、线粒体融合素2(Mitofusin 2,MFN2)、线粒体分裂蛋白 1(Fission1,Fis1)、动力相关蛋白 1(Dynamin-relatedprotein1,Drp1)表达观察LDZO对心衰大鼠心肌细胞线粒体动力学的影响;试剂盒检测腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)水平观察 LDZO对心衰大鼠心肌组织能量代谢的影响;Western blot检测脂肪酸转运途径相关蛋白磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)、一磷酸腺苷激活性蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、CD36、过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子 1α(peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1α,PGC1α)、沉默调节蛋白 3(silent mating-type information regulation 2 homolog 3,SIRT3)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(Carnitine palmitoyl transferasel,CPT1)表达和葡萄糖转运途径相关蛋白磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇-3 激酶(Phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)、蛋白磷酸酶 2(Protein phosphatase 2,PP2)、蛋白磷酸酶 1(Proteinphosphatase 1,PP1)、蛋白激酶 B(Proteinkinase B,Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(Phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、葡萄糖转运蛋白 4(Glucose transporter 4,GLUT4)的表达寻找探索LDZO改善能量代谢的途径。3.LZDO对缺氧缺糖心肌细胞内线粒体的影响首先采用氯化钴(CoCl2)和无糖培养基联合培养的方法复制心肌细胞缺氧缺糖模型,利用MTT确定其损伤心肌细胞50%的浓度。再用不同浓度LZDO作用于H9C2细胞24小时,确定LZDO对正常心肌细胞是否有毒性,在此基础上筛选LZDO对缺氧缺糖H9C2细胞损伤有保护作用的高、中、低三个浓度。将细胞分为:空白组、缺氧缺糖组、LZDO高、中、低剂量组,观察LZDO对缺氧缺糖H9C2细胞损伤的保护作用,胶原收缩实验观察LZDO对缺氧缺糖H9C2细胞收缩功能的影响,并用缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达来验证。观察LZDO对缺氧缺糖心肌细胞的线粒体功能的影响,检测不同组别的细胞中超氧化岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、线粒体膜电位、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、线粒体融合MFN1、MFN2、分裂蛋白Fis1、Drpl表达,观察LZDO对心衰大鼠线粒体功能的影响;检测心肌组织FFA、ATP水平、能量代谢途径中的脂肪酸转运途径相关蛋白p-AMPK、AMPK、CD36、PGC1αα、SIRT3、CPT1表达和葡萄糖转运途径相关蛋白p-PI3K、PI3K、PP2、PP1、P-Akt、Akt、GLUT4的表达,观察LZDO对心肌组织能量代谢途径的影响。4.LZDO改善缺氧缺糖心肌细胞能量代谢的途径分别采用AMPK抑制剂Compound C和AMPK激动剂5-氨基咪哇-4-甲酰胺核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside,AICAR)抑制或激动心肌细胞 AMPK 的表达,PI3K/AKT抑制剂wortmannin和PI3K/AKT激动剂胰岛素样生长因子-I(Insulin like Growth Factor-I,IGF-I)抑制或激动心肌细胞PI3K/AKT的表达,再通过WB观察LZDO对心肌细胞线粒体融合、分裂以及AMPK-CD36-脂肪酸途径和PI3K-GLUT4-葡萄糖途径的相关蛋白水平影响来明确LDZO改善能量代谢的途径。结果1.LZDO可提高心梗致慢性心衰大鼠的心功能利用结扎冠状动脉方法制备心梗致慢性心衰大鼠模型时心电图出现异常S-T节点升高的表现。造模4和8周后,各组大鼠体重出现明显差异,TMZ和LZDO组的大鼠体重比模型组显著增加。超声心动图结果表明,灌胃给药8周后模型组的大鼠心脏泵血功能降低,说明模型复制成功。给予不同浓度的LZDO后,心衰大鼠心脏射血分数、左心室短轴缩短率、每搏输出量、每分输出量明显升高,左心室收缩期容量降低。血流动力学结果同超声心动图,LZDO三个剂量组均能显著升高LVSP、±dp/dtmax、SBP、DBP、MAP,而LVEDP降低。HE染色结果显示,模型组的大鼠心脏心肌细胞重度变性坏死,肌原纤维溶解,排列紊乱,基质密度降低,细胞间隙扩大。在用LZDO治疗后能减轻心肌细胞坏死、间质纤维结缔组织增生及炎细胞浸润,与模型组比较症状有明显改善。Masson染色结果显示,模型组大鼠心脏可见蓝色胶原沉积增多,细胞外基质重构明显,胶原沉积增加,纤维化程度显著。而在给予LZDO之后,各剂量组能够不同程度地改善这一现象,尤其以高剂量组的效应最为明显。2.LZDO对提高慢性心衰大鼠心肌细胞的线粒体功能心衰大鼠心肌细胞内线粒体功能下降,表现为SOD含量明显减少,MDA明显增多,寻找其原因发现心肌细胞凋亡增加,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比例显著降低,Caspase3表达显著增加,由于线粒体融合蛋白MFN1、MFN2表达显著减少,分裂相关蛋白Fis1、Drp1显著增加导致线粒体产生的能量减少,ATP水平下降、FFA含量显著增加,脂肪酸转运相关蛋白p-AMPK/AMPK、CD36、PGC1α、SIRT3、CPT1蛋白水平显著减少,葡萄糖转运相关蛋白PDH表达显著减少,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GLUT4、PP2、PP1显著增加导致能量代谢降低。给予LZDO后,心衰大鼠心肌细胞的线粒体功能明显改善,MDA含量降低,SOD含量增加,线粒体抗氧化能力增强。由于Bcl-2/Bax 比例显著升高,Caspase3表达显著减少,细胞凋亡减少。心肌线粒体融合蛋白MFN1、MFN2表达显著增加,分裂蛋白Fis1、Drp1显著减少使得线粒体产能增多,ATP含量升高,FFA的利用增加,另外脂肪酸转运相关蛋白p-AMPK/AMPK、CD36、PGC1α、SIRT3、CPT1蛋白水平显著增加,葡萄糖转运相关蛋白PDH蛋白水平显著增加,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GLUT4、PP1显著减少使得能量代谢得到明显改善。3.LZDO明显改善缺氧缺糖心肌细胞的线粒体功能首先明确CoCl2复制缺氧缺糖心肌细胞模型的浓度为600μM,然后确定造模时间为12小时,在该条件下心肌细胞HIF-1α蛋白表达升高。明确了 LZDO的细胞毒性,低于1mM时对H9C2细胞活力没有显著影响,说明LZDO的安全范围大。在此基础上发现LZDO对缺氧缺糖心肌细胞损伤具有明显的保护作用,且浓度在1、10、100μM之间存在浓度依赖关系。胶原收缩实验结果显示与模型组比较,LZDO各浓度均可降低细胞胶原环面积,提示其可增强心肌细胞的收缩能力。缺氧缺糖组的心肌细胞受损,故细胞上清中LDH明显增多,细胞内MDA含量增加、SOD含量下降、线粒体膜电位下降、ROS表达增多,其原因与心肌细胞凋亡增加有关,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax 比例显著下降,Caspase3表达显著增加、线粒体融合蛋白MFN1、MFN2表达显著减少,分裂相关蛋白Fis1、Drp1显著增加,表明线粒体功能下降,ATP的生成减少,FFA的利用减少,脂肪酸转运相关蛋白p-AMPK/AMPK、CD36、PGC1α、SIRT3、CPT1蛋白水平显著减少,葡萄糖转运相关蛋白PDH表达显著减少,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GLUT4、PP2、PP1显著增加导致线粒体产能减少。给予LZDO后,细胞上清中LDH含量减少,细胞内MDA含量减少、SOD含量增加、线粒体膜电位恢复、ROS表减少,Bcl-2/Bax 比例显著增加,Caspase3表达显著减少,表明细胞凋亡减少,线粒体功能明显改善。心肌线粒体融合蛋白MFN1、MFN2表达显著增加,分裂蛋白Fis1、Drp1显著减少使得线粒体产能增多,ATP含量升高,FFA的利用增加,脂肪酸转运相关蛋白p-AMPK/AMPK、CD36、PGC1α、SIRT3、CPT1蛋白水平显著增加,葡萄糖转运相关蛋白PDH蛋白水平显著增加,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GLUT4、PP1 显著减少所致。4.LZDO改善缺氧缺糖心肌细胞能量代谢的途径使用激动剂AICAR后结果显示,与模型组比较,P-AMPK/AMPK、CD36、PGC1α、SIRT3、CPT1蛋白水平显著增加;MFN1、MFN2表达显著增加,Fis1、Drp1显著减少;给予LZDO后与模型组比较,P-AMPKAMPK、CD36、PGC1α、SIRT3、CPT1显著增加,且AICAR与LZDO联合应用其效果有叠加的趋势,MFN1、MFN2表达显著增加,Fis1、Drp1显著减少。使用AMPK抑制剂Compound C后发现与模型组比较,P-AMPK/AMPK、CD36、PGC1α、SIRT3、CPT1蛋白水平显著减少,MFN1、MFN2表达显著减少,Fis1、Drp1显著增加。在Compound C的基础上给予LZDO结果显示与抑制剂组比较,P-AMPK/AMPK、CD36、PGC1α、SIRT3、CPT1显著增加;MFN1、MFN2表达显著增加,Fis1、Drp1显著减少,提示LZDO可以通过AMPK/CD36途径来调控线粒体的融合与分裂来改善能量代谢。使用PI3K激动剂IGF-I后结果显示与模型组比较,P-PI3K、PP2A、PP1、P-Akt、GLUT4显著增加,PDH蛋白水平增加不明显;给予LZDO结果显示与模型组比较,P-PI3K/PI3K、PP2A、PP1、P-Akt/Akt、GLUT4显著减少,PDH蛋白水平显著增加;与IGF-I组比较,PP1蛋白显著减少。使用PI3K抑制剂 wortmannin 后结果显示与模型组比较,P-PI3K/PI3K、PP2A、PP1、P-Akt/Akt、GLUT4显著增加,PDH蛋白水平显著减少;给予LZDO结果显示与抑制剂组比较,P-PI3K/PI3K、PP2A、PPI、P-Akt/Akt、GLUT4显著减少,PDH蛋白水平显著增加;提示LZDO也可以通过PI3K/GLUT4途径改善能量代谢。结论1.LZDO可以明显改善心梗致慢性心衰大鼠心功能,改善心肌组织形态和纤维化,减少心肌细胞的凋亡。2.LZDO可以明显改善心肌细胞线粒体功能,促进心肌细胞脂肪酸转运、促进脂肪酸代谢,相对减少葡萄糖转运、增加糖酵解来促进心肌细胞产能增多,并通过促进心脏线粒体融合、减少分裂来促进能量代谢,增强心肌收缩能力,其可通过AMPK/CD36途径和PI3K/GLUT4途径实现其效应。