目的:缺血-再灌注(I/R)损伤是一种常见的临床病理生理过程，临床上因I/R损伤导致的急性脏器功能衰竭十分常见。胃肠道黏膜是人和动物体内最易受损的组织，远比其它脏器更易发生缺血-再灌注损伤，有鉴于此，对于各种病理性原因引起的胃I/R很有深入研究的必要。NF-κB是一类具有多项转录调节作用的核蛋白因子，它与细胞凋亡的关系密切，参与了多种凋亡相关基因的转录调控。本实验室以往研究的是夹闭腹腔动脉30min所致胃缺血-再灌注后细胞凋亡的发生，但由于体内环境的复杂性，不可能排除诸多因素的干扰，也难以特异性的针对胃黏膜某一细胞进行研究。因此，对于离体胃黏膜上皮细胞缺氧/复氧后细胞调亡的研究有十分重要的意义。此外，本实验室研究提示，大鼠单纯胃缺血-再灌注后，对NF-κB有激活作用；NF-κB的活性增加具有促进细胞凋亡、加剧细胞损伤的作用。本课题采用胃黏膜上皮细胞株建立模拟缺血-再灌注损伤模型，观察在复灌不同时间点模拟缺血-再灌注损伤诱导胃黏膜上皮细胞凋亡的作用及NF-κB在模拟缺血-再灌注损伤后的活性变化和NF-κB的抑制剂-PDTC对凋亡的影响。 方法: 1.模拟缺血模型建立及模拟缺血-再灌注损伤诱导胃黏膜上皮细胞凋亡的作用：本试验采用北京肿瘤研究所提供的胃黏膜上皮细胞株进行体外培养并传代，细胞以缺氧(5％CO2、1％O2、94％N2)+无糖KR液模拟缺血，复氧、复糖模拟再灌注诱导胃黏膜上皮细胞凋亡，用流式细胞仪法、Hoechst33258染色法观察正常对照组及模型损伤组于模拟缺血1h复灌3、6、12、24、48h细胞凋亡的情况及变化规律。 2.NF-κB在模拟缺血-再灌注后胃黏膜上皮细胞凋亡中的作用选择模拟缺血1h复灌后6h，用免疫组化和Western blot法检测模拟缺血1h复灌6h后正常对照组、模型损伤组NF-κB的蛋白表达、激活情况。 3.NF-κB抑制剂PDTC在模拟缺血-再灌注导致胃黏膜上皮细胞凋亡中的作用在进行模拟缺血再灌注损伤前24h，应用NF-κB的抑制剂PDTC，然后按照模型组进行细胞损伤，选择模拟缺血1h复灌6h时，用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的情况，并用流式细胞仪检测不同剂量(5、10、20μmol·L-1)NF-κB的抑制剂PDTC对胃黏膜上皮细胞凋亡的影响。用免疫组化和Western blot法检测模拟缺血1h复灌6h后正常对照组、模型损伤组及PDTC用药组NF-κB的蛋白表达及PDTC对NF-κB的抑制情况。 结果: 1.胃黏膜上皮细胞的培养及传代：倒置显微镜下观察，胃黏膜上皮细胞12～24h贴壁；24h后有可见少量上皮样细胞从周边爬出；48h后见细胞呈指数样生长；72h后细胞已基本能达到融合，镜下观察可见细胞体积较大，细胞间紧密相连融合成片，核椭圆形，呈多边鹅卵石铺路样。传代后的细胞生长迅速，约2～3日后可传代。证明本研究中胃黏膜上皮细胞的体外培养及传代成功可行。 2.I/R损伤模型建立及模拟缺血-再灌注损伤诱导胃黏膜上皮细胞凋亡的作用：流式细胞仪分析细胞再灌注3、6、12、24、48h的凋亡率分别达(2.34±0.27)％、(6.68±0.56)％、(2.84±0.68)％、(11.28±1.20)％、(19.20±1.03)％，其中以再灌注6h时凋亡显著增高，24小时后凋亡再次增加。模拟缺血1h复灌6h时倒置显微镜下观察到了胃黏膜上皮细胞的形态学变化、Hoechst染色法观察到细胞凋亡核的变化。相关分析表明，模拟缺血再灌注损伤可以诱导胃黏膜上皮细胞凋亡，凋亡率于再灌注6h时出现明显的增加。 3.NF-κB在模拟缺血-再灌注后胃黏膜上皮细胞凋亡中的作用： 模拟缺血1h复灌6h时用免疫组化和Western blot法检测正常对照组、模型损伤组NF-κB的表达、激活情况。免疫组化结果显示：胃黏膜上皮细胞模拟缺血1h复灌6h后，细胞核内NF-κB的表达明显增高；Western blot结果显示，细胞核内NF-κB的蛋白表达增加，灰度值与正常对照组相比具有显著性差异。 4、NF-κB抑制剂PDTC在模拟缺血-再灌注导致胃黏膜上皮细胞凋亡中的作用： (1)模拟缺血1h复灌6h时应用NF-κB的特异性抑制剂PDTC(5、10、2 0μmol·L-1)，经流式细胞仪检测三个不同剂量组，胃黏膜上皮细胞凋亡百分率(三个剂量组的凋亡率分别为6.24±0.86％、3.27±0.33％、6.57±0.61％)，以10μmol·L-1组效果最好，5μmol·L-1和20μmol·L-1组与模型组相比尽管细胞凋亡率有所下降，但无显著性差异。实验结果表明：使用10μmol·L-1PDTC后培养胃黏膜上皮细胞24h再模拟缺血-再灌注损伤细胞调亡率明显下降，PDTC可抑制胃黏膜上皮细胞凋亡。 (2)模拟缺血1h复灌6h时用免疫组化和Western blot法检测正常对照组、模型损伤组及PDTC预处理组NF-κB的表达、激活情况：免疫组化结果显示：胃黏膜上皮细胞模拟缺血1h复灌6h后，细胞核内NF-κB的表达明显增高，在模拟缺血前应用PDTC预处理细胞，可降低模拟缺血-再灌注损伤引起的细胞核NF-κB的表达；Western blot结果显示，在胃黏膜上皮细胞模拟缺血1h复灌6h后，细胞核内NF-κB的活性明显增高，与正常对照组相比具有显著性差异，在模拟缺血前应用PDTC预处理细胞，缺血-再灌注损伤后细胞核内NF-κB灰度值明显降低，有统计学意义灰度值。 结论: 1、成功地进行了胃黏膜上皮细胞体外培养并传代，建立了物理方法的模拟缺血-再灌注细胞损伤模型，并经流式细胞仪凋亡率分析、Hoechst核染色证实体外培养的胃黏膜上皮细胞在经历模拟缺血再灌注损伤后可诱导细胞凋亡，且凋亡于再灌注6h时出现明显的增高。 2、模拟缺血-再灌注时胃黏膜上皮细胞核内的NF-κB可被激活，NF-κB的激活可能是导致细胞凋亡的因素。 3、应用NF-κB特异性抑制剂PDTC可显著降低模拟缺血-再灌注后细胞核NF-κB表达，抑制细胞凋亡率，对胃黏膜上皮细胞有保护作用。