猪丹毒(swine erysipelas),也叫"钻石皮肤病"(diamond skin disease)或"红热病"(red fever),是由红斑丹毒丝菌引起的一种急性、热性传染病。多年以前,猪丹毒和猪瘟、猪肺疫并称猪三大传染病,给我国的养猪业造成了巨大的损失。随着养猪生产中抗生素和疫苗的大量使用,猪丹毒的发病得到了有效控制并一度销声匿迹。因此,目前猪丹毒在猪的传染病防控中受重视程度不高,对猪丹毒的致病特性、毒力变化、流行状况知之甚少。然而2013年7月以来,本实验室从不同猪场的送检病料中分离到了 7株疑似猪丹毒杆菌,经PCR鉴定,均确定为猪丹毒杆菌。同时,全国多地也陆续有关于猪场流行猪丹毒的报道,说明我国猪丹毒的发病率呈上升趋势。为了监控目前我国猪丹毒杆菌在猪群中的状态,探查其是否发生了毒力、耐药性等方面的变异,本研究通过血清型鉴定、spaA高变区序列分析、脉冲场凝胶电泳、吖啶橙敏感性试验、小鼠致病试验和药敏试验,对分离的猪丹毒杆菌进行了一次系统的鉴定。同时为了研究猪丹毒杆菌的致病机制,将其中一株分离株HX130709置于含吖啶橙的培养基上连续传55代,得到了致弱株HX130709a。利用上述强、弱毒株进行了小鼠感染猪丹毒杆菌后的细胞因子检测、3D4/21细胞体外吞噬试验和不同方式菌苗的免疫特性研究,以期对猪丹毒杆菌的致病机制研究和疫苗研发提供新的思路。具体研究内容分为以下4个部分:1.猪丹毒杆菌的分离和鉴定2013年7月至2013年11月,本实验室陆续收到来自湖北南漳、安徽和县、宣城、江苏泗洪、盐城等地送来的病料7份,送检脏器(心、肝、脾、肺)均呈典型败血症变化,脾脏损伤最为严重,充血、肿胀十分明显。主诉病猪突然死亡,有些死亡猪只从不吃食到死亡仅1d时间。为确定病原,按常规无菌操作分离并纯化细菌,根据其形态特征和PCR鉴定结果,结合临床症状,确诊为猪丹毒杆菌感染。该菌在TSA平板、BHI平板和鲜血平板上均生长良好。显微镜观察可见革兰氏阳性短杆菌,亦有少量丝状长杆菌出现。为了分析各地流行猪丹毒的原因,探究这几株猪丹毒杆菌之间的关系,我们对上述7个临床分离株、本实验室2009年分离保存的一个猪丹毒临床分离株以及市场上流通的弱毒疫苗株G4T10共9个菌株进行了系统的鉴定,结果显示这9个菌株都为血清1型,其中4株对吖啶橙敏感,所有临床分离株都对小鼠有很高的致死性。与疫苗株的spaA序列相比,8个分离株可以分为4个spa4型。脉冲场凝胶电泳(PFGE)结果未见完全相同的脉冲场带型。药敏试验结果表明,该类菌对β-内酰胺类和大环内酯类抗生素敏感,对卡那霉素和磺胺异恶唑耐受。2.猪丹毒杆菌分离株的致弱及其致弱株的特性鉴定选取8个临床分离株中对吖啶橙最敏感的HX130709株进行致弱,以期得到毒力减弱或丧失的猪丹毒杆菌致弱株。将HX130709株接种到AO-BHI平板上,连续传代的同时增加吖啶橙的浓度,每隔5代冻存细菌,并对保存的各代次细菌进行系统鉴定,结果发现:随着在AO-BHI平板上的传代,该菌对吖啶橙的耐受能力从0.0025%上升至0.03%;小鼠致病试验证明该菌的毒力在F46-F50之间发生了致弱,将致弱株命名为HX130709a;扩增保存的各代次细菌的spaA序列,在432bp的高变区未发现任何突变;脉冲场凝胶电泳结果显示从F15开始,各代次细菌的PFGE带型基本一致;药敏试验结果显示:相较于HX130709株,HX130709a株对大部分抗生素的敏感性有了大幅增强,尤其是对链霉素、四环素、多西环素和林可霉素的敏感性从耐受直接变为敏感,但是致弱株对恩诺沙星、环丙沙星依然表现中度敏感,对卡那霉素、磺胺异恶唑完全耐受。本次实验获得了猪丹毒杆菌致弱株HX130709a,为筛选猪丹毒杆菌毒力因子打下了基础。3.猪丹毒杆菌的致病特性研究为了研究猪丹毒杆菌的致病机制,将猪丹毒强毒株HX130709和弱毒株HX130709a分别感染小鼠,在感染后6h、12h、24h、36h和48h分别处死小鼠,分离脾淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,然后用实时荧光定量PCR方法检测小鼠脾淋巴细胞IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ的表达水平。同时,将强、弱毒株分别感染猪肺泡巨噬细胞系3D4/21细胞,在孵育30min、60min、90min和120min后,洗去多余细菌,固定细胞,封片后用激光共聚焦显微镜观察细胞吞噬细菌的情况。结果显示,猪丹毒杆菌弱毒株在感染早期,能刺激小鼠产生高水平的IL-10,而中后期对小鼠IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的刺激不明显;强毒株在感染早期,可以诱导小鼠产生高水平的IFN-γ,中期能刺激IL-2、IL-4尤其是IL-6的高表达,后期各细胞因子表达量降至低水平。强毒株对3D4/21细胞的抗吞噬能力强于弱毒株。猪丹毒强、弱毒株感染小鼠后诱导细胞因子的水平以及对3D4/21细胞的抗吞噬能力的差异,为猪丹毒杆菌的致病机制研究提供了参考。4.猪丹毒不同形式菌苗的免疫特性研究通过对猪丹毒杆菌临床分离株分别进行1%甲醛和0.4%吖啶橙灭活、制备高压菌体浸出物、沉淀细菌后取培养物上清,将上述四种灭活形式的疫苗经乳化后,和致弱株一起,分别免疫小鼠并对免疫效果进行比较,以期寻找一种高效、安全的疫苗。各试验组小鼠分别皮下注射1.5 × 109CFU/只的灭活细菌、等量细菌的高压浸出物或培养物上清;致弱株的接种剂量为1×107CFU/只,每只注射O.1mL;对照组小鼠皮下每只注射O.1mLPBS。共进行两次免疫,一免后第14天进行二免,二免后第14天时,按强毒株1×104CFU/只的剂量进行攻毒,每只小鼠注射O.1mL。试验中,分别在一免后7天、14天、28天、42天进行小鼠尾尖采血,并用间接ELISA方法检测SpaA抗体水平。结果表明,上清组、AO组、高压浸出物组、甲醛组虽然能够诱导小鼠体内SpaA抗体的产生,但抗体水平非常低;而弱毒组在一免后的第14天与第28天,抗体始终保持在较高水平。攻毒试验表明灭活形式的疫苗不能为小鼠提供完全的保护;相比之下,弱毒苗所用剂量小,而且能完全保护小鼠免于猪丹毒杆菌强毒株的致死性感染。