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目的:研究应用SD(Sprague-Dawley)大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液,诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外跨胚层诱导为视网膜样细胞的可能性。方法:1、SD大鼠MSCs的分离和培养:采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠MSCs,并用流式细胞仪对细胞纯度进行鉴定。2、SD大鼠视网膜片的取材:在显微镜下,彻底取下SD大鼠视网膜神经上皮层作为视网膜片。并对其常规石蜡切片HE染色鉴定各层组织结构的完整性。3、视网膜片光损伤:在超净台内,将取下的SD大鼠视网膜片放入盛有Neurobasal培养基A(其中加入1:50的B27和0.5M L-glutamine)中,用(1950±200) Lux的光照强度照射45min,用电镜观察其光损伤程度。4、大鼠MSCs诱导分化的条件培养液制备:条件培养液Ⅰ:将SD大鼠视网膜片光损伤后的培养上清液与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合而成。条件培养液Ⅱ:未光损伤SD大鼠视网膜片培养的上清液与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合而成。条件培养液Ⅲ:直接用Neurobasal培养基A与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合制成。5、大鼠MSCs体外诱导成视网膜样细胞:3种条件培养液均培养诱导至第3代的SD大鼠骨髓间充质干细胞7-8d。用倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态学改变。6、用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测视紫红质(Rhodopsin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NES)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein ,GFAP)等特征性标记在诱导后细胞中的表达情况。结果:1、流式细胞仪鉴定经贴壁筛选法可获得大量高纯度的大鼠MSCs。2、HE染色显示所取的SD大鼠神经上皮层结构完整。3、电镜结果显示光损伤后的SD大鼠视网膜片结构损伤严重。4、诱导7-8d后的SD大鼠MSCs置倒置相差显微镜下观察:条件培养液Ⅰ诱导组的细胞有较多突起,发生迁移并建立突触联系,而条件培养液Ⅱ及条件培养液Ⅲ只有少数细胞发生上述改变。5、免疫细胞化学染色显示:3组不同检测指标阳性率分别为:条件培养液Ⅰ组Rhodopsin(37.97±7.84)%、NSE(21.59±2.98)%、GFAP(20.73±5.25)%,条件培养液Ⅱ组Rhodopsin(10.23±2.05)%、NSE(16.24±1.10)%、GFAP(15.92±0.96)%,条件培养液Ⅲ组Rhodopsin(0)、NSE(6.24±4.58)%、GFAP(4.96±1.79)%。将三种培养条件下所表达的阳性细胞分别进行统计学分析,组间差异有统计学意义。RT-PCR鉴定也显示同样结果:条件培养液Ⅰ组Rhodopsin(0.3915±0.00644)、NSE(0.2019±0.00682)、GFAP(0.1972±0.00211),条件培养液Ⅱ组Rhodopsin(0.0983±0.00319)、NSE(0.1048±0.00323)、GFAP(0.1040±0.00254),条件培养液Ⅲ组Rhodopsin(0.0044±0.00126)、NSE(0.0498±0.00149)、GFAP(0.0467±0.00333)。结论:光损伤SD大鼠视网膜片培养上清液可诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为视网膜样细胞,研究结果为干细胞治疗视网膜变性疾病提供新思路。