宫颈癌是导致全世界女性死亡的第二位恶性肿瘤,流行病学研究表明持续感染高危型HPV(human papillomaviruses)16/18是导致宫颈癌发生的主要原因。高危型HPV主要依赖病毒基因组编码的两个病毒癌基因E6/E7来诱导感染细胞恶性转化,而高危型HPVE7又是导致宫颈癌发生的主要癌蛋白。E7蛋白的致癌活性主要是依赖与视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)的结合,使其泛素化降解,从而释放具有活性的E2F,激活E2F的靶基因表达,从而促进宫颈癌的发生发展。然而,在宫颈癌中E7/E2F下游与宫颈癌发生发展相关的精确信号转导通路尚不清楚。因此该论文旨在探索HPVE7/E2F的下游靶通路,为宫颈癌的诊断与治疗提供分子基础。通过分析四个公开报道的宫颈癌相关基因表达芯片数据,选取在四个数据库中均表达上调2倍以上的基因。然后运用TFSEARCH (ver.1.3)软件预测上述哪些基因的启动子序列上含有E2F的结合位点。我们发现核糖核苷酸还原酶亚基M2基因RRM2在四个数据库中均表达上调2倍以上,RRM2的启动子区域包含两个E2F可能的结合位点。这些提示RRM2可能是HPVE7调控的靶基因。RRM2蛋白是核苷酸还原酶的重要组成成分,是DNA合成过程中的限速酶。核苷酸还原酶的活性与癌细胞的分裂分化密切相关。许多研究表明RRM2与肿瘤的恶性生物学行为紧密相关,如过表达RRM2与肿瘤细胞的侵袭、转移和血管生成有关。RRM2能够激活一系列原癌基因促进肿瘤的生长,包括NF-κB、c-myc、v-fes和鸟氨酸脱羧酶等,但是RRM2调控这些原癌基因的机制尚不清楚。RRM2过表达可以促进活性氧自由基的产生,活性氧能够激活肿瘤生长过程中所需的MAPK、NF-κB和AP1的活性,在肿瘤的生长、转移和血管生成中起着重要作用。然而,目前还不清楚ROS是否参与到RRM2所介导的恶性肿瘤发生过程。本研究通过生物信息学的预测,发现在RRM2启动子区有两个保守的E2F结合位点,荧光素酶活性试验证明了RRM2是HPVE7下游的靶基因。HPVE7是通过结合Rb蛋白,使释放的E2F转录因子结合到RRM2的启动子区调节其转录活性。对宫颈癌组织的免疫组化分析表明RRM2的蛋白表达水平和E7的表达呈正相关。这些结果证明了RRM2可能是HPVE7的下游靶基因。其次本研究首次阐明了HPVE7通过RRM2调控HIF-la和VEGF表达的分子机制。有研究报道,HPVE7能上调HIF-la和VEGF的表达,而具体分子机制不明。另有研究报道,RRM2可以通过上调VEGF的表达,促进肿瘤细胞的血管生成,但其具体的调控机制尚不清楚。于是我们假设RRM2作为HPVE7下游的靶基因,可能是通过促进VEGF的表达来影响宫颈癌的血管生成,从而在宫颈癌的发展中发挥作用。本文研究发现在宫颈癌细胞系中过表达RRM2,可以促进活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成,ROS能够激活ERKl/2信号通路使HIF-1α和VEGF的表达增加。当加入活性氧清除剂NAC后,由过表达RRM2所引起的ERK1/2信号通路激活以及HIF-1α和VEGF的表达上调被抑制。另外体外血管形成实验表明,由E7调控的RRM2过表达能够促进HUVECs的血管形成,并且RRM2促进血管的形成是VEGF依赖的。在异种移植小鼠模型中,过表达RRM2的C33A细胞注射小鼠后,促进了肿瘤的生长,同时也增加了血管的形成密度。所以,本项目研究证实RRM2是受HPVE7调控的下游靶基因,HPVE7通过上调RRM2,产生ROS激活ERK1/2信号通路,促进HIF-1α和VEGF的表达,进而促进肿瘤的血管新生和最终导致癌症发生。这些结果证明了一个新的HPV相关的宫颈癌发生的信号通路即HPVE7-RRM2-ROS-ERK-HIF-1α-VEGF信号通路。因此,抑制RRM2的活性可能成为治疗人类宫颈癌的一个新策略。