转移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)作为连接遗传信息和对应氨基酸之间的“接头分子”，是蛋白质合成中的关键生物大分子之一。tRNA的核苷酸残基上存在着广泛的转录后修饰，这些修饰对于tRNA在细胞内发挥功能起着重要作用。甲基化修饰是tRNA修饰中最广泛的，它可以发生在核苷酸的碱基或者核糖上。大部分的tRNA甲基化反应都由依赖腺苷甲硫氨酸的甲基转移酶催化。然而，关于tRNA甲基转移酶的催化和底物识别机制的研究较少。　　SPOUT甲基转移酶超家族成员TrmJ是存在于细菌以及古菌中的tRNA32位2-O-甲基转移酶。通过研究，我们发现，大肠杆菌TrmJ(EcTrmJ)可以在体外独立催化六种不同tRNA底物的甲基化修饰，它识别tRNA的三级结构的拐肘区域而非接受茎部分。晶体结构显示EcTrmJ形成不对称的同源二体，其SPOUT结构域和延伸结构域均能独立形成二体。结合生物化学实验，我们进一步证实这两个结构域均参与了对底物tRNA的识别，且连接两者的一段不保守柔性铰链区在这一过程中起到了关键的调节作用。　　NSun家族成员是真核生物中最主要的RNA∶m5C甲基转移酶。2015年，人细胞质NSun6(hNsun6)被报道能够催化tRNA第72位的甲基化修饰。我们通过质谱检测、定点突变及酶学动力学等生物化学手段鉴定出tRNA上参与hNSun6识别的关键元件;发现hNSun6的识别依赖于tRNA的倒L型三级结构，以及位于tRNA接受茎和D茎的特定的碱基或碱基对。具体识别元件为:(1)全长且正确折叠的tRNA;(2)CCA末端以及催化位点C72;(3)接受茎上的U73;(4)接受茎第二和第三对碱基对;(5)D茎的两对碱基对(11∶24和12∶23)。　　由于缺乏三级结构信息，NSun家族成员的RNA底物识别机制以及RNA∶m5C的催化机制长期悬而未决。因此，我们解析了hNSun6单体的晶体结构及其与全长形式tRNA的复合物晶体结构。我们解析的结构表明tRNA与hNSun6结合后会发生构象变化使目标胞嘧啶的碱基部分可暴露出来被酶催化甲基化。结合生物化学实验，我们阐明了RNA:m5C甲基转移酶家族的底物识别机制和催化机制。