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目的：
RAS蛋白是小分子膜结合蛋白，RAS蛋白质家族中存在三种同种型：KRAS、HRAS和NRAS，RAS家族成员的致癌突变在众多人类肿瘤中发现，发生率较高的是胰腺癌(90%)、结肠腺癌(50%)、肺腺癌(30%)和白血病(30%)。因此，RAS突变是众多肿瘤发生的的关键驱动因素，是一个重要的治疗靶点。但是由于RAS蛋白结构的特殊，针对RAS蛋白研发的小分子抑制剂并不能有效抑制RAS蛋白的活性。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种异质性血液系统恶性肿瘤，NRAS突变在AML中发生约有25%，KRAS突变约有15%，NRAS突变的也影响着AML患者的预后，存在此突变患者常规化疗效果差且预后不良。
本课题通过蛋白激酶抑制实验分析急性髓系白血病细胞系THP-1中处于高活性状态的信号通路，并进一步分析信号通路活性增高与RAS突变的关系，阐明急性髓系白血病细胞系THP-1增殖的分子机制。
方法：
按照处理方式的不同，实验组为蛋白激酶抑制剂或细胞因子处理组，对照组仅做DMSO处理：将18种不同的蛋白激酶抑制剂作用于急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60，CCK8法检测细胞增殖抑制情况；RT-PCR扩增THP-1细胞NRAS基因，测序，检测NRAS突变位点；多种受体蛋白激酶抑制剂联合作用于NRAS突变型细胞株THP-1及HL-60，CCK8方法检测细胞增殖抑制情况；细胞因子TPO、EPO、M-CSF单独、联合作用于NRAS突变型细胞株THP-1及HL-60，检测细胞增殖情况；采用慢病毒转染方法将针对PI3KCA的shRNA导入THP-1细胞，构建PI3KCA低表达的THP-1细胞株，CCK8方法检测细胞增殖情况；GSK-2126458(60nmol/L)、NVP-BGJ-398(1μmol/L)、rapamycin(1μmol/L)、GSK-690693(1μmol/L)、AZD-6244(1μmol/L)作用于THP-1、HL-60及K562细胞系，Westernblot检测细胞内各信号通路中关键激酶的活性；采用软琼脂平板克隆增殖检测药物作用后THP-1克隆增殖情况；GSK-2126458作用于THP-1与K562细胞24h、48h、72h后，采用AnnexinV-FITC染色检测细胞凋亡情况。
结果：
通过蛋白激酶抑制实验，急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60在GSK-2126458作用下其增殖能够被有效抑制；GSK-2126458能够通过促进THP-1细胞凋亡抑制细胞增殖。测序得到THP-1存在NRAS突变；将多种受体蛋白激酶抑制剂联合作用于THP-1、HL-60，细胞增殖并未受到明显抑制；细胞因子单独或联合作用于THP-1，与对照组相比细胞增殖无明显升高，P＞0.05。软琼脂克隆实验显示GSK-2126458作用于THP-1后，与对照相比细胞增殖克隆数明显降低，P＜0.05；Westernblot结果显示，GSK-2126458作用于THP-1，细胞AKT磷酸化水平明显降低，P＜0.05。
结论：
1.急性髓系白血病细胞系THP-1中PI3K/AKT信号通路活性增高。
2.NRAS突变激活下游PI3K激酶，进而激活PI3K/AKT信号通路来促进THP-1细胞增殖。
3.通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性能够抑制细胞增殖，为伴RAS突变的AML患者治疗提供新思路。
RAS蛋白是小分子膜结合蛋白，RAS蛋白质家族中存在三种同种型：KRAS、HRAS和NRAS，RAS家族成员的致癌突变在众多人类肿瘤中发现，发生率较高的是胰腺癌(90%)、结肠腺癌(50%)、肺腺癌(30%)和白血病(30%)。因此，RAS突变是众多肿瘤发生的的关键驱动因素，是一个重要的治疗靶点。但是由于RAS蛋白结构的特殊，针对RAS蛋白研发的小分子抑制剂并不能有效抑制RAS蛋白的活性。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种异质性血液系统恶性肿瘤，NRAS突变在AML中发生约有25%，KRAS突变约有15%，NRAS突变的也影响着AML患者的预后，存在此突变患者常规化疗效果差且预后不良。
本课题通过蛋白激酶抑制实验分析急性髓系白血病细胞系THP-1中处于高活性状态的信号通路，并进一步分析信号通路活性增高与RAS突变的关系，阐明急性髓系白血病细胞系THP-1增殖的分子机制。
方法：
按照处理方式的不同，实验组为蛋白激酶抑制剂或细胞因子处理组，对照组仅做DMSO处理：将18种不同的蛋白激酶抑制剂作用于急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60，CCK8法检测细胞增殖抑制情况；RT-PCR扩增THP-1细胞NRAS基因，测序，检测NRAS突变位点；多种受体蛋白激酶抑制剂联合作用于NRAS突变型细胞株THP-1及HL-60，CCK8方法检测细胞增殖抑制情况；细胞因子TPO、EPO、M-CSF单独、联合作用于NRAS突变型细胞株THP-1及HL-60，检测细胞增殖情况；采用慢病毒转染方法将针对PI3KCA的shRNA导入THP-1细胞，构建PI3KCA低表达的THP-1细胞株，CCK8方法检测细胞增殖情况；GSK-2126458(60nmol/L)、NVP-BGJ-398(1μmol/L)、rapamycin(1μmol/L)、GSK-690693(1μmol/L)、AZD-6244(1μmol/L)作用于THP-1、HL-60及K562细胞系，Westernblot检测细胞内各信号通路中关键激酶的活性；采用软琼脂平板克隆增殖检测药物作用后THP-1克隆增殖情况；GSK-2126458作用于THP-1与K562细胞24h、48h、72h后，采用AnnexinV-FITC染色检测细胞凋亡情况。
结果：
通过蛋白激酶抑制实验，急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60在GSK-2126458作用下其增殖能够被有效抑制；GSK-2126458能够通过促进THP-1细胞凋亡抑制细胞增殖。测序得到THP-1存在NRAS突变；将多种受体蛋白激酶抑制剂联合作用于THP-1、HL-60，细胞增殖并未受到明显抑制；细胞因子单独或联合作用于THP-1，与对照组相比细胞增殖无明显升高，P＞0.05。软琼脂克隆实验显示GSK-2126458作用于THP-1后，与对照相比细胞增殖克隆数明显降低，P＜0.05；Westernblot结果显示，GSK-2126458作用于THP-1，细胞AKT磷酸化水平明显降低，P＜0.05。
结论：
1.急性髓系白血病细胞系THP-1中PI3K/AKT信号通路活性增高。
2.NRAS突变激活下游PI3K激酶，进而激活PI3K/AKT信号通路来促进THP-1细胞增殖。
3.通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性能够抑制细胞增殖，为伴RAS突变的AML患者治疗提供新思路。