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目的:
RAS蛋白是小分子膜结合蛋白,RAS蛋白质家族中存在三种同种型:KRAS、HRAS和NRAS,RAS家族成员的致癌突变在众多人类肿瘤中发现,发生率较高的是胰腺癌(90%)、结肠腺癌(50%)、肺腺癌(30%)和白血病(30%)。因此,RAS突变是众多肿瘤发生的的关键驱动因素,是一个重要的治疗靶点。但是由于RAS蛋白结构的特殊,针对RAS蛋白研发的小分子抑制剂并不能有效抑制RAS蛋白的活性。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种异质性血液系统恶性肿瘤,NRAS突变在AML中发生约有25%,KRAS突变约有15%,NRAS突变的也影响着AML患者的预后,存在此突变患者常规化疗效果差且预后不良。
本课题通过蛋白激酶抑制实验分析急性髓系白血病细胞系THP-1中处于高活性状态的信号通路,并进一步分析信号通路活性增高与RAS突变的关系,阐明急性髓系白血病细胞系THP-1增殖的分子机制。
方法:
按照处理方式的不同,实验组为蛋白激酶抑制剂或细胞因子处理组,对照组仅做DMSO处理:将18种不同的蛋白激酶抑制剂作用于急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60,CCK8法检测细胞增殖抑制情况;RT-PCR扩增THP-1细胞NRAS基因,测序,检测NRAS突变位点;多种受体蛋白激酶抑制剂联合作用于NRAS突变型细胞株THP-1及HL-60,CCK8方法检测细胞增殖抑制情况;细胞因子TPO、EPO、M-CSF单独、联合作用于NRAS突变型细胞株THP-1及HL-60,检测细胞增殖情况;采用慢病毒转染方法将针对PI3KCA的shRNA导入THP-1细胞,构建PI3KCA低表达的THP-1细胞株,CCK8方法检测细胞增殖情况;GSK-2126458(60nmol/L)、NVP-BGJ-398(1μmol/L)、rapamycin(1μmol/L)、GSK-690693(1μmol/L)、AZD-6244(1μmol/L)作用于THP-1、HL-60及K562细胞系,Westernblot检测细胞内各信号通路中关键激酶的活性;采用软琼脂平板克隆增殖检测药物作用后THP-1克隆增殖情况;GSK-2126458作用于THP-1与K562细胞24h、48h、72h后,采用AnnexinV-FITC染色检测细胞凋亡情况。
结果:
通过蛋白激酶抑制实验,急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60在GSK-2126458作用下其增殖能够被有效抑制;GSK-2126458能够通过促进THP-1细胞凋亡抑制细胞增殖。测序得到THP-1存在NRAS突变;将多种受体蛋白激酶抑制剂联合作用于THP-1、HL-60,细胞增殖并未受到明显抑制;细胞因子单独或联合作用于THP-1,与对照组相比细胞增殖无明显升高,P>0.05。软琼脂克隆实验显示GSK-2126458作用于THP-1后,与对照相比细胞增殖克隆数明显降低,P<0.05;Westernblot结果显示,GSK-2126458作用于THP-1,细胞AKT磷酸化水平明显降低,P<0.05。
结论:
1.急性髓系白血病细胞系THP-1中PI3K/AKT信号通路活性增高。
2.NRAS突变激活下游PI3K激酶,进而激活PI3K/AKT信号通路来促进THP-1细胞增殖。
3.通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性能够抑制细胞增殖,为伴RAS突变的AML患者治疗提供新思路。
RAS蛋白是小分子膜结合蛋白,RAS蛋白质家族中存在三种同种型:KRAS、HRAS和NRAS,RAS家族成员的致癌突变在众多人类肿瘤中发现,发生率较高的是胰腺癌(90%)、结肠腺癌(50%)、肺腺癌(30%)和白血病(30%)。因此,RAS突变是众多肿瘤发生的的关键驱动因素,是一个重要的治疗靶点。但是由于RAS蛋白结构的特殊,针对RAS蛋白研发的小分子抑制剂并不能有效抑制RAS蛋白的活性。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种异质性血液系统恶性肿瘤,NRAS突变在AML中发生约有25%,KRAS突变约有15%,NRAS突变的也影响着AML患者的预后,存在此突变患者常规化疗效果差且预后不良。
本课题通过蛋白激酶抑制实验分析急性髓系白血病细胞系THP-1中处于高活性状态的信号通路,并进一步分析信号通路活性增高与RAS突变的关系,阐明急性髓系白血病细胞系THP-1增殖的分子机制。
方法:
按照处理方式的不同,实验组为蛋白激酶抑制剂或细胞因子处理组,对照组仅做DMSO处理:将18种不同的蛋白激酶抑制剂作用于急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60,CCK8法检测细胞增殖抑制情况;RT-PCR扩增THP-1细胞NRAS基因,测序,检测NRAS突变位点;多种受体蛋白激酶抑制剂联合作用于NRAS突变型细胞株THP-1及HL-60,CCK8方法检测细胞增殖抑制情况;细胞因子TPO、EPO、M-CSF单独、联合作用于NRAS突变型细胞株THP-1及HL-60,检测细胞增殖情况;采用慢病毒转染方法将针对PI3KCA的shRNA导入THP-1细胞,构建PI3KCA低表达的THP-1细胞株,CCK8方法检测细胞增殖情况;GSK-2126458(60nmol/L)、NVP-BGJ-398(1μmol/L)、rapamycin(1μmol/L)、GSK-690693(1μmol/L)、AZD-6244(1μmol/L)作用于THP-1、HL-60及K562细胞系,Westernblot检测细胞内各信号通路中关键激酶的活性;采用软琼脂平板克隆增殖检测药物作用后THP-1克隆增殖情况;GSK-2126458作用于THP-1与K562细胞24h、48h、72h后,采用AnnexinV-FITC染色检测细胞凋亡情况。
结果:
通过蛋白激酶抑制实验,急性髓系白血病细胞系THP-1、HL-60在GSK-2126458作用下其增殖能够被有效抑制;GSK-2126458能够通过促进THP-1细胞凋亡抑制细胞增殖。测序得到THP-1存在NRAS突变;将多种受体蛋白激酶抑制剂联合作用于THP-1、HL-60,细胞增殖并未受到明显抑制;细胞因子单独或联合作用于THP-1,与对照组相比细胞增殖无明显升高,P>0.05。软琼脂克隆实验显示GSK-2126458作用于THP-1后,与对照相比细胞增殖克隆数明显降低,P<0.05;Westernblot结果显示,GSK-2126458作用于THP-1,细胞AKT磷酸化水平明显降低,P<0.05。
结论:
1.急性髓系白血病细胞系THP-1中PI3K/AKT信号通路活性增高。
2.NRAS突变激活下游PI3K激酶,进而激活PI3K/AKT信号通路来促进THP-1细胞增殖。
3.通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性能够抑制细胞增殖,为伴RAS突变的AML患者治疗提供新思路。