论文部分内容阅读
本研究将利用抗体库技术，体外筛选、克隆、表达去唾液酸糖蛋白受体的单链抗体，并对单链抗体的靶向性进行分析，观察重组scFv-Melittin肝脏的靶向能力以及破溶酶体膜功能，并探讨重组Tat-TK融合蛋白的跨膜效应，为进一步构建基因靶向运输及治疗载体奠定基础。【目的】从人源噬菌体抗体库（Tomlinson I Library）中筛选与ASGPR特异性结合的单链抗体，研究其靶向肝细胞特异性；Melittin与该单链抗体融合蛋白的破溶酶体膜功能；以及Tat介导HSV1-TK融合蛋白的跨膜效应，为肝脏疾病的靶向治疗研究奠定基础。【方法】1．去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位CRD（CRDH1）的表达、纯化与鉴定根据CRDH1的DNA序列设计一对引物，以质粒CRDH1／pET3为模板，PCR扩增CRDH1基因并定向插入至原核表达质粒pET-32c中，IPTG诱导表达，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重组融合蛋白CRDH1（rCRDH1）；常规方法处理包涵体，Ni2+亲和柱纯化融合蛋白，在AKTA Prime液相色谱仪用HiTrap Desalting column进行脱盐，核酸蛋白测定仪测其浓度，采用Band Leader软件分析其纯度；并通过WB检测其与兔抗人ASGPR血清的免疫反应性。2．抗rCRDH1单链抗体的筛选、表达与鉴定以原核表达纯化的rCRDH1作为筛选分子，从人源噬菌体抗体库（Tomlinson I）中筛选与去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位CRD区特异性结合的噬菌体，对人源化噬菌体抗体库进行四轮固相筛选，所获得的阳性克隆用表达纯化的原核表达载体pET-32c中的亲和标签（Trx-His-s tag）进行差异筛选，SDS-PAGE检测可溶性表达，通过ABI3730全自动荧光测序仪对获得能分泌性表达特异性抗CRDH1单链抗体的噬菌体克隆进行DNA测序分析；制备阳性克隆噬菌体并感染表达宿主菌HB2151，经IPTG诱导单链抗体的表达，收集表达菌上清并用饱和硫酸铵沉淀上清中的单链抗体，IMAC柱纯化后，经12％SDS-PAGE电泳、Western-blot及免疫组化方法分析检测纯化抗体的特性。3．单链抗体-Melittin融合蛋白的构建与效应测定人工合成编码Melittin的两条寡核苷酸单链（GenBank：X02007），两端分别引入NotⅠ和SacⅡ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，30％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；NcoⅠ和NotⅠ双酶切含抗去唾液酸糖蛋白单链抗体C1基因的载体C1／pIT2，低融点琼脂糖凝胶回收C1，采用分子克隆技术将其定向克隆至原核表达载体pGC中。将含C1M／pGC的XL1-Blue单菌落接种至LB肉汤培养基中培养，并通过IPTG诱导表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化，免疫印迹技术（WB）分析重组蛋白C1M的抗原结合能力，溶血试验分析C1M的生物学活性。4．Tat11-TK的融合表达与功能鉴定合成编码HIV-Tat47-57（Tat11）的两条寡核苷酸单链（Gen-BankNC 001802），两端分别引入BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，采用分子克隆技术将其定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含Tat11-TK／pET-32的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养，并通过IPTG诱导表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat11-TK的膜结合能力，免疫印迹技术（WB）分析该融合蛋白的穿膜能力。【结果】1．rCRDH1的制备及免疫原性NcoⅠ和XhoⅠ酶切鉴定和DNA测序结果表明，克隆基因的DNA序列与CRDH1的DNA序列完全一致，说明构建成功；含重组表达质粒CRDH1／pET-32c的BL21菌经IPTG诱导后表达出一约35.0kDa大小的融合蛋白；对表达菌液超声后上清和沉淀经SDS-PAGE检测表明，融合表达的rCRDH1以包涵体形式存在。Ni2+亲和纯化后，获得较纯（纯度大于95％）的rCRDH1重组融合蛋白，纯化的重组融合蛋白能被兔抗ASGPR阳性血清特异性识别，而与抗ASGPR阴性对照血清呈阴性反应。2．单链抗体的特异性经第四轮筛选的产物，随机取60个克隆经ELISA检测结果显示，24株与rCRDH1重组抗原有较好结合活性，其中有14株与重组蛋白标签有交叉反应，10株阳性噬菌体与鼠不同组织提取的可溶性抗原，大肠杆菌抗原均无交叉反应；10株阳性噬菌体克隆中有2株经IPTG诱导表达培养上清与rCRDH1抗原有较强的特异性结合活性，两株阳性噬菌体分别命名为C1、C2；经PCR扩增，C1和C2的扩增片段长约900bp，DNA序列分析证实基因全长均为729bp，包括VH、VL和linker序列，VH处于linker的上游，VL处于linker的下游，均带有3个互补决定簇，由（Gly4Ser）3组成linker，拼接完全正确。C1和C2为两株不同的抗去唾液酸糖蛋白rCRDH1单链抗体。与人抗体胚系基因数据库相比较表明，重链V区属于人免疫秋蛋白VH3家族，起源于免疫球蛋白胚系基因VH DP-47；轻链V区属于VKI亚家族，起源于免疫球蛋白胚系基因DPK9，C1的GenBank登录号：VH：AY789442；VL：AY789443。3．单链抗体-Melittin融合蛋白的特性成功构建原核表达质粒C1M／pGC，并经测序证实；在大肠杆菌XL1-Blue中有效表达出重组融合蛋白C1M；表达产物以可溶性形式存在；纯化的C1M大小为29.4kDa，浓度为0.6mg／ml；免疫组化结果说明C1M能有效识别去唾液酸糖蛋白受体，红细胞溶血试验证明具有裂解红细胞膜功能。4．Tat介导HSV1-TK的跨膜功能表达产物经SDS-PAGE在60.7kDa左右显示条带，符合Tat11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni2+螯合柱亲和纯化获得的Tat11-TK重组融合蛋白经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，免疫印迹结果显示Tat11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内。【结论】通过基因重组技术与蛋白质化学技术获得具有抗原性的rCRDH1蛋白，以其作为筛选靶分子，通过与Trx-His-s tag的差异筛选，从人源噬菌体抗体库中筛选获得两株特异性抗rCRDH1的scFv，纯化的单链抗体可与rCRDH1和肝癌组织以及正常肝组织特异性结合，表明所获得的单链抗体具有功能活性与特异性，为进一步研究其肝靶向特异性以及靶向基因治疗奠定了基础；该单链抗体与Melittin的融合蛋白，不仅保留了单链抗体的结合特异性，且可同时具有一定破膜作用；进一步成功构建蛋白转导肽Tat与自杀基因HSV1-TK的原核表达载体，亲和纯化的Tat11-TK具有较强的跨膜能力；综合运用重组融合肽Melittin的溶酶体破膜和Tat介导的跨膜功能，结合筛选得到的scFv靶向ASGPR功能，有可能为非病毒载体基因治疗肝疾病开辟新的途径。