家蚕30K蛋白是在家蚕血液中大量表达的一类低分子量脂蛋白,也是桑蚕特有的一类蛋白质。该类蛋白由脂肪体合成,并分泌到血液中,它们是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋白之一,也是家蚕胚胎发育的重要能源物质。30K蛋白成员众多,其氨基酸序列同源性较高,因此对这类蛋白进行分离纯化较为困难。目前,已经分离纯化出的30K蛋白只有4种。家蚕基因组框架图的完成为我们提供了大量的数据资源,利用这些数据预测到10个30K蛋白基因,这些基因所编码的氨基酸数目在246-271个之间,理论等电点在6.1-8.4之间,分子量在28-31kD之间,它们的氨基酸序列同源性都在60%以上。本研究通过分析各类30K蛋白的理论等电点和分子量,设计并开展了30K蛋白的纯化工作,获得了一种新的30K蛋白,在此基础上对该蛋白进行了相关的分析和研究,主要结果如下:本研究首先参考了10个30K蛋白的理论分子量和等电点,设计了分离纯化的实验流程和实验条件。通过硫酸铵沉淀和三种层析分离技术(阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析),对家蚕血液蛋白质进行分离纯化,最终获得一种30K蛋白。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)检测,所获得的蛋白样品信号峰单一。同时,通过MALDI-TOF-MS获得该蛋白的肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF),利用GPMAW(General Protein/MassAnalysis for Windows)软件搜索家蚕蛋白质理论数据库,该蛋白被鉴定为30K蛋白基因Bmlp7编码的蛋白LP7,且其序列与已报道的所有30K蛋白序列均有较大差异。利用多克隆抗体制备技术,将分离纯化获得的30K蛋白LP7作为抗原,采取多次皮下注射的方法对家兔进行免疫,颈动脉放血法采集血液,获得其抗血清。通过饱和硫酸铵沉淀法粗提抗血清中的抗体,去掉了大量杂质和部分杂蛋白,最后获得了抗30K蛋白LP7的抗体粗品,达到下一步实验的要求。通过Western blot技术,分别对家蚕5龄起、5龄第3天和羽化第3天的各个组织器官进行检测。结果发现,5龄起时,只在血液中检测到LP7;5龄3天时,血液中的LP7杂交信号强度明显增加,此外,在头、脂肪体和生殖腺中均检测到LP7,体壁和中肠中也有少量LP7存在,而丝腺和马氏管中没有检测到任何杂交信号。同时,分析家蚕5龄3天组织芯片数据,结果表明Bmlp7基因在头、脂肪体、体壁和生殖腺中表达,其中头的表达量最高,在丝腺和马氏管中只有微量表达,而在中肠和血液中没有表达。因此,我们推测5龄第3天血液中增加的LP7蛋白是由脂肪体中合成后转移而来的;中肠的微量LP7可能从血液中转移而来;丝腺和马氏管中Bmlp7基因的表达量较低,导致蛋白水平上检测不到。对羽化第3天的组织器官进行检测,发现所有组织中均存在LP7,但此时该蛋白在雌性生殖腺中的信号强度远远高于其他组织。LP7蛋白在家蚕大量组织器官中的广泛存在,暗示该蛋白在家蚕的生长发育过程中起着非常重要的作用。同时,利用Western blot技术对家蚕部分时期的血液与生殖腺进行对比分析。发现在血液中,从5龄第3天开始检测到明显LP7杂交信号,并且随着生长发育的进行其强度逐渐增加,到化蛹第1天达到最大值,而后逐渐降低,羽化第3天时杂交信号已非常微弱;而在生殖腺中,5龄第3天的LP7杂交信号非常微弱,而后逐渐增加,蛾期达到最大值。这一结果表明生殖腺中的LP7蛋白可能是由血液中转移而来,并参与了卵母细胞的形成,推测该蛋白在家蚕胚胎发育过程中起着一定作用,可能是胚胎发育的重要能源物质。检测化蛹第6天的雌雄生殖腺,结果显示雌雄生殖腺中均存在LP7,表明该蛋白在家蚕生殖发育过程中具有重要作用。进一步分析家蚕芯片时期表达谱,结果表明30K蛋白基因Bmlp7的表达量从5龄后期急速增加,吐丝前后达到最大,此后急剧下降,从上簇后的一段时间到化蛹4天,其表达又有缓慢上升的趋势,化蛹5天后表达量有所降低,到化蛾时又上升。而已有的研究报道表明该基因在脂肪体中的表达只持续到化蛹第5天。因此,推测30K蛋白LP7从血液转移到生殖腺的同时,其他组织中也可能合成该蛋白。此外,利用玻璃毛细管注射器,将黑曲霉菌(一种真菌)注射到化蛹3天的蚕蛹体内,分别提取注射24h和48h后的血液,通过Western blot技术检测血液中30K蛋白LP7的变化情况。发现在注射黑曲霉菌的家蚕蛹期血液中,LP7杂交信号有微弱增强,而对照组中,LP7杂交信号趋于降低。注射黑曲霉菌后,血液中的LP7有增加的趋势,这可能是由于黑曲霉菌导致家蚕体内Bmlp7基因mRNA的表达量增加,也可能是外来物质在某种程度上阻止了血液中LP7蛋白的转移,从而导致血液中LP7蛋白含量增加。这一结果暗示30K蛋白LP7可能与家蚕免疫系统相关。综上所述,本研究从家蚕血液中分离纯化到一种新的30K蛋白LP7。并制备了LP7蛋白的多克隆抗体,结合30K蛋白基因Bmlp7的芯片数据分析结果,对该蛋白的功能进行了初步研究。为进一步研究LP7蛋白以及其他30K蛋白的功能创造了条件,同时为家蚕免疫机制的研究提供了新的切入点。