论文部分内容阅读
研究背景 胃癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，死亡率仅次于肺癌和肝癌。临床上早期胃癌的确诊率低，中晚期主要采用手术切除联合化疗或单纯化疗方案。胃癌易发生化疗耐药，严重影响预后。顺铂是胃癌化疗药物之一，胃癌对顺铂的耐药限制了其应用。相关研究已经证实非常规前折叠素RPB5作用因子URI是一个癌蛋白，与RPB5结合后能够参与调控基因转录。我们的前期研究发现URI增加多种癌细胞对常见化疗药物的抵抗，降低重铬酸钾导致的DNA损伤并促进损伤后的修复，对线虫和果蝇的研究也揭示URI能够一定程度上维护基因组的稳定性，而近年来对顺铂的耐药机制的研究发现DNA损伤修复的增加是肿瘤细胞顺铂耐药的原因之一。因此，本文主要以URI在胃癌细胞DNA损伤修复中的作用为切入点探讨影响胃癌细胞顺铂耐药性的机制。 研究目的 以人低分化胃癌MGC-803细胞株和来源于低分化胃癌淋巴结转移病灶的SGC-7901细胞株为研究对象，通过对两株细胞URI的敲低，探究顺铂作用下URI对胃癌细胞耐药性及DNA损伤修复的影响，探索URI是否通过ATM/CHK2修复通路促进胃癌细胞的DNA损伤修复，进一步探明URI影响胃癌细胞耐药性的潜在机制。 研究方法 （1）采用转染试剂Hiperfect分别在人胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中瞬转URI特异性小干扰片段siRNA-A构建URI干扰细胞株，以转染无关序列片段组和未转染组为对照，用qRT-PCR和Western blot分别检测各组细胞中URI在mRNA和蛋白水平的表达量，对URI敲低细胞株的构建进行验证。 （2）彗星实验检测不同浓度顺铂作用下细胞的DNA损伤，Western blot检测URI敲低组与各对照组在有无顺铂作用下的γH2AX表达情况。 （3）CCK-8法检测不同浓度顺铂作用下各组细胞的细胞活力，并根据活力值计算顺铂的IC50；EDU法检测各组细胞在顺铂作用下的增殖情况。 （4）流式细胞术检测顺铂处理后URI敲低组与对照组细胞的凋亡。 （5）Western blot检测顺铂处理后的各组细胞在0h、6h、12h修复时间时，细胞DNA损伤修复通路相关蛋白的表达量及磷酸化水平。 （6）流式细胞术检测顺铂作用下的各组细胞经12h修复后的周期分布情况。 研究结果 （1）siRNA-A转染后胃癌细胞URI的表达 qRT-PCR和Western blot结果显示，转染URI干扰片段siRNA后，MGC-803和SGC-7901细胞中URI的mRNA和蛋白水平表达量与对照组相比均显著降低。 （2）顺铂可导致胃癌细胞DNA损伤且URI敲低后损伤增加 彗星实验中，顺铂作用后两株细胞的OTM值均增加，且随着顺铂作用浓度的增加呈递增趋势，说明随着顺铂浓度增加，DNA的损伤程度增加；Western blot检测出顺铂作用后各组细胞的γH2AX水平升高，且顺铂处理后的URI敲低组细胞γH2AX表达量与对照组相比明显增加，表明URI能减少顺铂导致的胃癌细胞DNA损伤。 （3）敲低URI减弱胃癌细胞活力与增殖能力 CCK-8检测结果显示与对照组相比，URI敲低组胃癌细胞活力降低，顺铂的IC50值降低，说明URI增加了胃癌细胞对顺铂的抵抗；EDU结果显示顺铂作用下，敲低URI减弱了细胞的增殖能力。 （4）URI减弱顺铂诱导的胃癌细胞凋亡 顺铂作用后的胃癌细胞经流式细胞术检测显示，URI敲低后MGC-803细胞的早期凋亡与对照组相比明显增加，SGC-7901细胞的晚期凋亡明显增加，二者的总凋亡率均明显增高。 （5）URI影响顺铂作用下胃癌细胞DNA损伤修复通路相关蛋白的表达 顺铂处理后的各组细胞与未处理组相比，DNA损伤修复通路中的P-ATM和P-CHK2水平明显升高；顺铂作用后，给予细胞0h和6h的修复时间，URI敲低组胃癌细胞P-ATM和P-CHK2水平与对照组相比无明显差异，而修复时间为12h时， URI敲低组细胞P-ATM和P-CHK2水平较对照组均明显降低，说明URI敲低细胞中ATM/CHK2修复通路活性降低。 （6）URI促进顺铂诱导的胃癌细胞DNA损伤的修复 无顺铂作用时，敲低URI对胃癌细胞周期中各期所占比例影响不大，而顺铂作用4小时且修复12小时后，URI敲低组细胞与对照组相比出现G1期阻滞。这提示URI可减少顺铂导致的DNA的损伤，增加修复能力，促进细胞通过G1期进入分裂状态，增强细胞的耐药性。 结论 （1）URI能减少顺铂诱导的胃癌细胞DNA损伤，并促进损伤后的修复。 （2）URI通过ATM/CHK2修复通路，增强胃癌细胞DNA损伤修复能力，增加细胞对顺铂的耐药性。