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本试验根据美洲商陆抗病毒蛋白基因的序列,设计引物,通过PCR扩增,从中国商陆(Phytolacca acinosa)和美洲商陆(Phytolacca americana)叶片中分离了只对病毒有抑制作用而不干扰寄主植物生长的3个缺失无毒型PAP基因,进行序列测定。并将其中的2个基因利用农杆菌介导的叶盘法导入到了番茄,获得了转基因植株,分子生物学方法和人工接种鉴定法都证明,该基因已经整合到番茄基因组,并得到了表达,转基因植株对TMV的抗性明显增强。具体结果如下:
1、中国商陆和美洲商陆抗病毒蛋白基因的克隆。从美洲商陆叶片基因组中克隆得到了1个同时缺失N-端信号肽和C-端毒性区的缺失无毒型PAP基因PamPAP,长为714bp,该基因PamnPAP已经在GenBank登陆,登陆号为AY603352从中国商陆叶片基因组中克隆得到了2个缺失无毒型PAP基因PacPAP 1和PacPAP 2,长为714bp,序列不完全相同,在GenBank登陆号分别为AY603353和AY603354,登陆时间为2004年5月21日。
PamPAP与Lin 等(1991年)发表的PamPAPcDNA序列相比较,同源性达99.9%,只有一处碱基不一样,第90bp处为G而Lin等的为A。它们编码的氨基酸序列没有差异,第88-90号核苷酸为一个密码,CCA和CCG都编码脯氨酸(Pro)。PacPAP 1与Lin 等(1991年)发表的从美洲商陆中克隆的PamPAPcDNA序列同源性达99.7%,有两处碱基不一样,其中第344bp处为G而Lin等的为A,第563bp处为G而Lin等的为A。第343-345和562-564为一个密码子,该基因这两处的密码子均为AGA,编码精氨酸(Arg),而Lin(1991)分离的密码均为AAA,编码赖氨酸(Lys)。该基因片断为一个读码框,可编码238个氨基酸;另一个基因PacPAP2与Lin等(1991年)发表的从美洲商陆中克隆的PamPAPcDNA序列同源性达96.9%,有22处碱基不一样。
2、中国商陆和美洲商陆抗病毒蛋白基因表达载体的构建。将从中国商陆和美洲商陆中克隆的3个PAP基因(PamPAP,PacPAP1和PacPAP2)用BamHⅠ+XbaⅠ从克隆载体上酶切下来,回收小片段。用同样的酶酶切pBI121,用连接酶将两者连接起来,便得到了3个基因的植物表达载体。
3、中国商陆抗病毒蛋白基因对番茄的转化。采用农杆菌介导的叶盘法转化,将PacPAP1和PacPAP2导入黄樱桃番茄中,并且获得了转基因植株,结果表明:本研究利用从中国商陆中分离的两个缺失无毒型PAP基因转化番茄,得到的转基因番茄的生长没有异常情况,和对照一样正常生长,自交结实后得到了T<,1>代。对转基因番茄T<,1>代摩擦接种TMV和CMV进行抗病毒试验。接种TMV后50天,统计不同番茄材料发病情况,结果表明:非转基因黄樱桃番茄(CK1)表现为感病,非转基因感病品种(CK2)表现为感病,转基因番茄株系PacPAP1-1、PacPAP1-2、PacPAP2-1和PacPAP2-1病情指数依次为11.85、12.59、11.1和8.15,根据我国的番茄群体对TMV的抗性标准,这些株系的群体抗性都达到抗病级别。转基因番茄接种CMV后,没有任何症状,但阴性对照也没有任何症状,可能是用于转化的黄樱桃番茄本身就是一个抗CMV的材料,因此,其抗性的差异有待进一步的研究。