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研究背景卡波西肉瘤是一个多中心间充质来源的肿瘤。1872年Moritz Kaposi首先报道,主要见于意大利人、犹太人、地中海起源的老年人,新疆是一个多民族聚居的地方,在中国超过90%的卡波西肉瘤发生在新疆。卡波西肉瘤发病机制目前并不清楚,许多研究已经证明人疱疹病毒8型是卡波西肉瘤最重要的病原体。虽然人疱疹病毒8型在新疆普通人群中有很高的流行率,但人疱疹病毒8型并不是唯一致病因素,由于缺乏基因学的研究,卡波西肉瘤在这个人群中发病机理尚不清楚。新疆特定的地理、民族、环境可能导致卡波西肉瘤的特殊特点。MicroRNAs (miRNAs)是19-25个核苷酸,单链的非蛋白质编码的RNAs,在生物进程中扮演着重要的角色。miRNAs通过靶mRNA基因3’非翻译区互补序列达到调控靶nRNA表达的目的。miRNAs的功能包括信号转导,细胞分化,细胞增殖和细胞凋亡。miRNAs在肿瘤中的作用非常重要。他们包括促癌miRNA和肿瘤抑制miRNAs,参与调节、增殖,血管生成等。miRNAs在癌症中有着独特的表达谱,因此miRNAs可以作为诊断和对治疗的分子靶标。目的 (1)采用第七代miRCURYTM LNA Array(v.18.0) (Exiqon)芯片检测卡波西肉瘤miRNA差异表达谱。(2)人工合成miR-126-3p模拟物,抑制物等,对卡波西肉瘤细胞株SLK进行转染,通过一系列体外细胞生物学实验(细胞增殖、细胞迁移、侵袭、细胞凋亡及细胞周期)观察过表达或抑制miR-126-3p后对卡波西肉瘤细胞株SLK的生物性状的影响。(3)结合三种miRNA靶基因预测软件,发现miR-126-3p可与PIK3R2的3’UTR结合,因此推测PIK3R2极有可能为miR-126-3p的靶基因,本部分验证PIK3R2是miR-126-3p调控的靶基因。方法一、卡波西肉瘤miRNA差异表达谱分析选取6对2012年1月到2013年9月在我科就诊的卡波西肉瘤患者肿瘤和瘤旁组织,采用Trizol提取总RNA,分离并标记miRNA后制成杂交液,与第七代miRCURYTM LNA Array(v.18.0) (Exiqon)芯片杂交,再经洗片、扫描及数据分析处理,获得差异表达miRNA。采用实时荧光定量PCR方法在18对配对的卡波西肉瘤肿瘤和瘤旁组织中验证部分差异表达的miRNA,获得卡波西肉瘤miRNA表达谱,并对上述miRNA的表达量在病理分型、HIV感染、HHV-8感染、皮损面积的差异性进行统计学分析。二、miR-126-3p在卡波西肉瘤细胞株SLK中的功能研究(1)优化转染条件：通过转染不同浓度的阳性对照测定MTT值确定最佳转染浓度及最佳转染时间。(2)MTT检测细胞增殖活性：实验分模拟物组、抑制物组、阴性对照组、抑制物阴性对照组,转染后48h,在酶标仪上测定各孔的吸光度值(OD值),比较各组细胞的增殖情况。(3)转染miR-126-3p模拟物及抑制物后应用transwell小室,24小时后行苏木素染色观察细胞迁移、细胞侵袭生物学特性。(4)应用流式细胞仪检测转染miR-126-3p模拟物及抑制物48小时后各组细胞凋亡率及细胞周期。二、niR-126-3p靶向调控PIK3R2的机制研究(1)生物学软件预测miR-126-3p的靶基因。(2)运用qRT-PCR检测转染miR-126-3p模拟物、抑制物、阴性对照、抑制物阴性对照的SLK细胞PIK3R2的表达量,采用2-△△CT相对定量数据分析。(3)采用Western Blot方法检测转染了miR-126-3p模拟物及抑制物细胞中PIK3R2蛋白表达的改变。(4)合成预测靶点3’端非翻译区中含有目的miR-126-3p位点的片段,将该片段克隆于荧光素酶报告基因载体)miRGIO中,将PIK3R2突变型和野生型载体与niR-126-3p模拟物及抑制物共转染到293T细胞中,采用双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性。结果一、卡波西肉瘤miRNA差异表达谱分析(1)18对卡波西肉瘤均为维吾尔族,男女比例为17：1,平均年龄60.1±14.1岁。病程24.2±33.8月。11例CKS中HHV-8病毒感染率81.82%(9/11)。7例AIDS-KS中,6例患者感染HHV-8(85.71%)病毒。(2)卡波西肉瘤肿瘤和瘤旁组织中存在差异表达niRNA,在3100个miRNA探针中,有170个差异表达的miRNA,包括69个上调和101个下调的miRNAs,最显著的上调miRNAs是miR-126-3p, miR-199a-3p, miR-16-5p和13个KSHV相关miRNAs。显著下调的niRNAs有miR-125b-1-3p和miR-1183。经qRT-PCR验证上述10个miRNAs在18对卡波西肉瘤肿瘤和瘤旁组织中的表达水平与芯片结果一致。(3)经统计学分析显示,miR-125b-1-3p与HHV-8之间具有统计学意义(p=0.001),niR-16-5p与HIV之间具有统计学意义(p=0.018)。二、miR-126-3p在卡波西肉瘤细胞株SLK中的功能研究(1)MTT检测结果显示：与阴性对照组比较,miR-126-3p mimic组可以抑制细胞增殖,抑制率为19.62%±1.68(P<0.05)。而抑制miR-126-3p在SLK细胞中的表达,则促进细胞增殖(12.42%±1.79)(P<0.05),表明过表达miR-126-3p明显抑制SLK细胞增殖(P<0.01)。(2)应用Transwell小室检测转染miR-126-3p mimic、inhibitor、阴性对照、抑制物阴性对照后细胞迁移的能力,过表达miR-126-3p降低了SLK细胞迁移和侵袭数目；低表达miR-126-3p可以增加SLK细胞迁移和侵袭数目(P<0.05)。推测niR-126-3p可能具有抑制卡波西肉瘤细胞迁移和侵袭的能力。(3)应用流式细胞仪检测miR-126-3p对SLK细胞周期的影响,niR-126-3p mimic转染组G2/M期细胞所占比例[(30.75±0.64)%]明显高于阴性对照组[(4.70±0.99)%](P=0.00), miR-126-3p mimic转染组S期细胞所占比例[(10.85±1.49)%]明显低于阴性对照组[(40.80±0.99)%](P=0.00)。miR-126-3p inhibitor转染组S期细胞所占比例[(52.50±2.69)%]明显高于阴性对照组和inhibitor阴性对照组[(40.10±1.27)%](P<0.05),提示miR-126-3p可将SLK细胞阻滞于G2/M期,阻碍细胞进入分泌期。(4)应用流式细胞仪检测miR-126-3p对SLK细胞凋亡的影响,转染了miR-126-3pmimic之后SLK细胞早期凋亡率增加,与NC组比较,其凋亡率分别为20.53%±1.70和9.67%±0.31,转染了niR-126-3p inhibitor后,SLK细胞早期凋亡率为11.10%±0.95,与NC组细胞凋亡率比较,其凋亡率未见明显改变,表明miR-126-3p能够促进SLK三、细胞凋亡miR-126-3p靶向调控PIK3R2的机制研究(1)通过在线miRNA靶基因预测软件Mirbase, Miranda和Targetscan对miR-126-3p下游靶基因进行预测,取三个数据的交集,发现PIK3R2可能是miR-126-3p靶基因。(2)与阴性对照组比较,过表达miR-126-3p后PIK3R2基因水平下降,转染niR-126-3p inhibitor后PIK3R2基因水平升高,推测miR-126-3p对PIK3R2具有调控作用。(3)与阴性对照组比较,转染外源性miR-126-3p mimic到SLK细胞之后,细胞中PIK3R2蛋白表达水平明显减弱,反之,转染miR-126-3p inhibitor后,细胞中PIK3R2蛋白表达水平增强,说明miR-126-3p可负性调控PIK3R2蛋白的表达。(4)与阴性对照组相比,miR-126-3p与野生型质粒共转染使萤火虫荧光素酶活性下降,荧光素酶相对比值下降(P<0.05),而将PIK3R2-3’UTR-MUT同miR-126-3p共转染细胞后,荧光强度并无明显改变,无显著性差屏(P>0.05)。结论(1)初步筛选出170个卡波西肉瘤相关的niRNA,包括69个上调和101个下调的niRNAs。经qRT-PCR验证miRNA基因芯片结果可靠,提示这些niRNAs与卡波西肉瘤的发病机制密切相关,在疾病进程中发挥着重要作用。(2)miR-126-3p可以抑制细胞增殖,抑制细胞侵袭和迁移,促进细胞凋亡,诱导SLK细胞产生G2/M期阻滞,缩短S期细胞比率。推测miR-126-3p在卡波西肉瘤中可能起抑制类似抑癌基因的作用,负性调控卡波西肉瘤的生物学行为。(3)生物信息学分析表明PIK3R2基因3’UTR与niR-126-3p的结合区域高度保守。miR-126-3p可下调PIK3R2基因的表达,负性调控PIK3R2蛋白的表达。双荧光素酶报告基因活性检测证实PIK3R2是miR-126-3p直接作用的靶基因。