论文部分内容阅读
漆酶（Laccase,EC 1.10.3.2）是一种含有四个铜离子的多酚氧化酶,属于铜蓝氧化酶家族,能够催化多种酚类和非酚类的化合物,被广泛应用于环境修复、造纸工业、食品工业、生物检测等领域。然而,自然界中的漆酶酶活性低、表达水平低,不能高效氧化底物,限制了漆酶的广泛应用。因此,通过定向进化方法改善漆酶的特性（酶表达量、酶活性、选择性、稳定性和底物谱）,将会拓宽漆酶的应用范围和效率,尤其是在染料废水处理方面的应用。本研究选择了Moniliophthora roreri漆酶Lcc2基因和Tremetes viscolor漆酶Lcc基因进行研究,主要的研究内容和进展如下:1.为提高Tremetes viscolor漆酶Lcc的表达量,本研究主要针对漆酶转录调节区域进行定向进化。利用易错PCR,选择不同浓度的Mn2+对调节区域进行突变,并以酿酒酵母为宿主细胞进行异源表达,构建S.c/pYES2-Lcc调节子突变库。选用2,2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）为底物测定漆酶酶活的96孔板高通量筛选方法,对突变库中960株突变体进行筛选,并对酶活高的突变体进行摇瓶复筛,最终获得三株遗传稳定性良好的酶活较高地突变体M1、M2、M3,其粗酶液酶活分别是野生型菌株粗酶液酶活的1.73倍、1.46倍、1.37倍,突变菌株M1粗酶液酶活最高可达35.4 U/L。2.通过优化Lcc转录调控区域,发现漆酶突变体酶活提高不大,因此,通过文献调查,选择了一酶活力较高地来源于Moniliophthora roreri的漆酶Lcc2为研究对象,进行后续定向改造实验。基于毕赤酵母可进行高密度发酵,比酿酒酵母会表达更多外源蛋白质的优点,本章节选择利用毕赤酵母表达密码子优化后的Lcc2基因,获得重组质粒pPICZα-A-Lcc2。为提高漆酶催化高氧化还原电势底物HOBT的能力,利用易错PCR技术,Mn2+浓度为0.3 mmol/L建立Lcc2的随机高频突变库。利用ABTS为底物的活性检测方法对漆酶突变体进行初筛去除无活性和低活性菌株,并利用HOBT为底物进行复筛,最终获得1株对底物HOBT活力相对于野生型高1.2倍的突变体E3。将E3突变体和野生型Lcc2进行纯化,并用BCA试剂盒对纯酶进行蛋白质定量。利用ABTS为底物对突变体E3和野生型Lcc2进行酶学性质和动力学检测,结果显示:两者最适pH、最适温度一致,最适pH为3.0,最适温度为30℃,且以ABTS为底物时测得野生型Lcc2的Km值为37.61μmol·L-1,Kcat值为138.12 s-1,催化效率Kcat/Km为3.67 L·（μmol·s）-1。突变体E3的Km值为50.5μmol·L-1,Kcat值为133.65 s-1,催化效率Kcat/Km为2.65 L·（μmol·s）-1。3.利用毕赤酵母表达的野生型漆酶Lcc2协同小分子介体（1-羟基苯并三唑、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、藜芦醇、对香豆酸）对5类不同结构和类型的染料（偶氮类、三苯甲烷类、蒽醌类、靛蓝类、吩噻嗪类）进行脱色实验,并比较突变体E3和野生型漆酶Lcc2在HOBT介体辅助下对染料的脱色能力。结果表明,该野生型漆酶Lcc2在小分子介体HOBT的帮助下对属于偶氮类、三苯甲烷类、蒽醌类、靛蓝类的9种染料脱色率均能达到95%以上。对结构更复杂的杂环吩噻嗪类染料天青I的脱色效率均较低,在最佳介体对香豆酸辅助下仅仅达到40%的脱色率。通过进一步对天青I染料的脱色体系优化,发现在pH为6.0、对香豆酸浓度为2 mmol·L-1、漆酶浓度为125 U·L-1时,Lcc2对天青I的脱色率达到81%。相比野生型漆酶Lcc2,突变体E3在HOBT介体辅助下提高了对染料的脱色能力。对刚果红、活性黑5、活性艳蓝KN-R、苯酚红、考马斯亮蓝R、结晶紫、溴酚蓝、亮蓝R、靛蓝、靛蓝胭脂红、天青I等11种染料,突变体E3/HOBT介体系统的脱色能力分别是野生型/HOBT介体系统的1.39倍、1.43倍、1.66倍、2.28倍、2.25倍、1.45倍、1.52倍、1.32倍、1.27倍、2.2倍、1.21倍。