研究背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上主要引起肿瘤死亡的疾病之一。早期发现CRC是预后的关键,但是约有40%的CRC病人尽管经过积极治疗生存率也仅5年。CRC被认为是高度多样化的肿瘤,深入了解CRC的发病机制、肿瘤的发生发展、预后相关因素是非常必要的。阻碍TGF-β的肿瘤抑制作用是促进大多数肿瘤发生发展的共同分子机制,Smad4作为TGF-β信号通路的关键调节因子,位于染色体18q21,在胰腺癌中最先发现且经常缺失。Smad4的突变与缺失在CRC中占30%。在CRC细胞中Smad4表达异常和TGF-β水平升高促进肿瘤血管生成和转移使肿瘤恶化。肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor HGF)是与肿瘤生长和转移相关的最重要因素之一。HGF是多肽生长因子,与跨膜的酪氨酸激酶受体c-Met结合。HGF/c-Met信号通路在胚胎发育、组织创伤修复过程起着重要作用,同时信号通路异常也与肿瘤进展和不良预后密切相关。BAG-1是抗凋亡蛋白,具有多功能性,它与多种细胞蛋白相互作用并影响他们的功能。在细胞表面,它与生长因子受体的胞质部分结合,加强生长因子受体引发的抗细胞凋亡作用。在细胞质,BAG-1与Bcl-2和热休克蛋白结合,并调节他们的功能。在细胞核,BAG-1与多种核激素受体结合并抑制激素诱导的凋亡。BAG-1在多种肿瘤细胞和肿瘤组织中表达上调。HGF/c-Met信号转导通路的异常和TGF-β信号通路中Smad4的缺失、突变均对结直肠癌的发生、发展及预后有重要作用,且在结直肠癌中发生比例高,大多数研究者都是研究单一信号转导通路在CRC的作用,现在,在TGF-β/Smad信号传导通路缺失的条件下,尚未见有关HGF如何调控BAG-1在CRC中表达的研究报道。本实验在Smad4缺失的SW620、HT-29结直肠癌细胞中稳定转染Smad4,然后用HGF分别刺激转染后的阴性对照和Smad4过表达组,检测BAG-1基因和蛋白表达水平及对肿瘤细胞增殖、周期和迁移的影响。目的:探讨HGF/c-Met通路在Smad4不同背景下对CRC细胞BAG-1表达及对肿瘤细胞增殖、周期和迁移的影响。方法:应用免疫组化技术检测Smad4和BAG-1蛋白在结直肠癌中表达。用慢病毒载体转导Smad4缺失的细胞株SW620、HT-29,使其稳定表达Smad4,应用Western Blot和RT-PCR方法检测Smad4表达水平及HGF不同浓度(10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、80 ng/ml)和不同时间(0h、0.5h、1h、2h、4h)BAG-1的表达水平。应用CCK-8检测不同浓度HGF刺激阴性对照组和Smad4表达组对结直肠癌细胞增殖的作用,流式细胞术检测HGF对细胞周期的影响,细胞划痕实验检测HGF在对照组和Smad4表达组对细胞迁移的影响。结果:1.免疫组化结果显示Smad4在结直肠癌中呈低表达,BAG-1呈高表达。2.用慢病毒转染技术稳定获得Smad4过表达的SW620、HT-29细胞株。3.不同浓度HGF分别刺激SW620、HT-29细胞后检测BAG-1的表达,结果发现当40ng/ml HGF浓度刺激时,BAG-1蛋白表达水平最高。4.40ng/ml HGF刺激SW620、HT-29阴性对照组时,BAG-1的m RNA和蛋白表达上调。刺激Smad4过表达组时,BAG-1的m RNA和蛋白水平变化均不明显。5.不同浓度HGF刺激SW620、HT-29阴性对照组时促进了细胞增殖,且呈质量浓度依赖性。刺激Smad4过表达组时,HGF对促进肿瘤细胞增殖的作用不明显。6.HGF刺激SW620、HT-29阴性对照组时,细胞G1期和G2期比例降低,而S期比例明显升高,说明HGF增加了SW620、HT-29细胞的DNA合成,促进肿瘤细胞增殖。而Smad4过表达组变化不明显。7.HGF刺激SW620、HT-29阴性对照组时,细胞迁移明显,Smad4过表达组迁移不明显。结论:Smad4在结肠癌组织中呈低表达;BAG-1呈高表达。Smad4的过表达,抑制HGF对CRC细胞BAG-1表达的上调作用。Smad4的过表达,抑制了HGF对CRC的增殖和迁移作用。