论文部分内容阅读
黄连解毒汤（Huang-Lian-Jie-Du Decoction，HLJDD） 是中医方剂学中清热解毒的代表方剂之一，由黄连解毒汤全方（由黄连9g、黄芩6g、黄柏6g、栀子9g组成）经提取（水煎）加工而成。前人的药效学研究显示其有明显的镇痛抗炎功效。然而，目前大多数HLJDD的药效研究均限于运用传统中医理论解释其镇痛抗炎作用。本文从免疫学角度研究了黄连解毒汤对内毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠炎症模型的抗炎作用并初步探讨其分子机制。 【目的】 研究黄连解毒汤对LPS诱导的巨噬细胞炎症模型和小鼠炎症模型的抗炎效应并初步研讨其分子机制。 【方法】 1. 研究对象：C57BL/6小鼠，雄性，SPF级，8-10周龄；RAW264.7细胞系，购于国家实验细胞资源共享服务平台。 2. 动物模型：将HLJDD以7.5~15mg/只的剂量腹腔注射至C57BL/6小鼠体内，1小时后再腹腔注射10 mg/kg的LPS，处理后4小时眼球采血，血浆用于检测相关细胞因子的活性；或将30 mg/kg的LPS腹腔注射至C57BL/6小鼠体内，设置对照组及HLJDD组，观察各组五日生存率的差异。 3. 细胞模型：将HLJDD以0.25mg/mL的终浓度加入到RAW264.7细胞培养液上清中，在正常培养条件下孵育24小时，随后将培养液置换为含500 ng/mL LPS的无血清培养液继续培养1小时，随后取培养液上清或细胞进行相关实验。 4. 动物模型和细胞模型中细胞因子的检测：用小鼠细胞因子检测试剂盒检测炎症模型小鼠的血浆和炎症模型细胞的培养液上清中相关细胞因子的含量。 5. 细胞模型中蛋白质免疫印迹试验：检测炎症相关信号通路的有关蛋白在HLJDD预刺激组与LPS刺激组、对照组中表达情况的差异。 6. 细胞模型中NF-κB通路蛋白核转位的分析：研究HLJDD对炎症模型细胞中NF-κB（Nuclear factorκB）信号通路p65蛋白核转位的影响，用FITC标记Anti-Mouse-p65抗体进行细胞免疫染色，随后在共聚焦显微镜下观察并记录图像。 7. 细胞模型中mRNA的检测：提取炎症模型细胞的总RNA，经逆转录后，采用实时荧光定量PCR检测IL-6、IL-1β和TNF-α等相关细胞因子在各实验组间转录水平的差异。 8. HLJDD中内毒素的检测：使用ToxinSensor 终点显色法内毒素检测试剂盒考察所配制的黄连解毒汤中内毒素的含量。 【结果】 1. 动物生存实验结果显示：LPS休克小鼠的生存时间不超过24小时，预注射HLJDD的LPS休克小鼠生存率与LPS对照组相比有显著提高；HLJDD各单体组合后注射小鼠显示出了与HLJDD相似的抗炎活性；且随着各单体成分浓度的提高，其组合体对小鼠的抗炎作用也显著增强——小鼠可以自主进食；注射5天后小鼠达到完全缓解。 2. ELISA检测结果显示：LPS刺激后小鼠和RAW264.7细胞分泌的白介素-1β（Interleukin-1β， IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量显著提高，而HLJDD可不同程度地抑制这三种细胞因子含量的升高。 3. 蛋白免疫印迹实验结果显示：LPS刺激后RAW264.7细胞的NF-κB信号通路被激活，而HLJDD可抑制NF-κB信号通路中p65蛋白的磷酸化激活。 4. 共聚焦显微镜图像显示：LPS刺激后RAW264.7细胞的NF-κB p65蛋白发生了明显的核转位，而HLJDD可抑制这种核转位现象。 5. 实时荧光定量PCR检测结果显示：LPS刺激后RAW264.7细胞中NF-κB信号通路下游的靶基因TNF-α和IL-1βmRNA的含量明显升高，而HLJDD可不同程度地降低这些靶基因的转录水平。 【结论】 1. LPS的刺激使小鼠发生严重的内毒素休克，而HLJDD预注射可延长内毒素休克小鼠的生存时间甚至可长期生存。 2. LPS激活了小鼠巨噬细胞的NF-κB信号通路，使通路下游靶基因的表达增强，从而促进炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌。而HLJDD能抑制LPS诱导的巨噬细胞NF-κB信号通路的激活，抑制相关通路蛋白分子的表达， 抑制相关炎性细胞因子的分泌。 3. HLJDD对NF-κB信号通路的弱化作用是通过抑制通路中p65蛋白的核转位和磷酸化活化实现的。此弱化作用直接导致了通路下游炎性细胞因子基因表达减弱，细胞因子分泌减少，从而避免了LPS引起的细胞因子风暴对机体免疫系统的过度激活，即表现为良好的抗炎作用。