背景肝癌是常见的恶性肿瘤之一,占我国恶性肿瘤的第二位,全球每年新发原发性肝癌约26万例,我国约占其中的近1/2,在我国及东南亚地区,原发性肝癌发病率约为欧美国家的5～10倍,其男性标准化死亡率达14.52/10万,女性标准化死亡率为5.61/10万。目前认为外科手术仍是最主要的治疗方法。但由于肝癌发病隐匿,大多数患者就诊时已失去手术机会,导致总的5年生存率仅达38—47%。近年来,随着医学影像学的发展和临床生化检验技术的进步,原发性肝癌早期发现率已明显提高,治疗手段亦有了很大进步。随着分子生物学、免疫学理论和基因转移技术的发展及对肿瘤发病机制的深入认识,近年来基因治疗研究的重点逐渐由单基因缺陷所致的遗传病转向肿瘤这种多基因参与、多步骤形成的疾病。肝癌因其恶性程度高、预后差,各种治疗手段都不能显著延长患者的生存期、改善患者的生活质量而成为基因生物治疗研究的热点。肿瘤细胞膜肿瘤坏死因子受体Ⅰ（Membrane-bound tumor necrosis factorreceptorⅠ,mTNFRI）是一重要的死亡受体,是介导TNFα杀灭清除肿瘤细胞重要的感应器。体内外实验已证实mTNFRⅠ介导肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factorα,TNFα）的程序化死亡作用（apoptosis）、病毒感染肝细胞的清除作用以及其对肿瘤细胞的杀伤作用,是机体杀灭清除肿瘤细胞重要的靶位点。有研究表明TNFRI基因转移大大增强了肿瘤细胞膜的TNFRI表达以及TNF对肿瘤细胞的杀伤作用。大量证据提示抑制转录或蛋白质合成的药物是通过TNFα诱导程序化死亡的。然而mTNFRI可被蛋白水解酶作用后脱落形成sTNFRI,可结合TNFα,并以此阻止TNFα与细胞膜表面的TNF受体结合。因此,sTNFRI在体内具有重要的免疫抑制作用。前期已有研究表明肿瘤患者体内存在高水平sTNFRI,可能与迅速增殖的肿瘤及肿瘤细胞的裂解有关。我课题组已研究发现大肠癌患者血清中存在高水平的sTNFRI,其浓度与患者病情、病程及其复发、转移呈正相关系,并且提示其主要来源于肿瘤细胞膜TNFRI的释放.国外也有多项研究表明sTNFRI可作为恶性肿瘤的标志物。因而诱导并稳定肿瘤细胞膜mTNFRI对机体抗肿瘤作用至关重要。基质金属蛋白酶（matrix metallop roteinase,MMPs）是一类含Zn²⁺的内源性蛋白水解酶,是肿瘤细胞侵袭和转移的关键因素,目前发现基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）几乎在所有的肿瘤组织中均有高表达及高活性,MMPs不仅降解基底膜和细胞外基质的大部分成分,还参与释放以前体形式结合于细胞膜表面的多种细胞因子和/或生长因子及其受体,如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、死亡受体家族之一Fas受体等,经多种途径促进肿瘤细胞脱落、基底膜破坏、基质溶解及新生血管生成以实现肿瘤的侵袭与转移。其中基质金属蛋白酶9（MMP-9）被研究的最广泛,被认为是与肿瘤的转移和侵袭性关系最密切的金属蛋白酶。然而国内外有关肝癌组织及肝癌细胞中MMP-9的表达却一直没有统一定论。有研究表明MMP-9在肝癌组织中明显高于癌旁组织,并提示可能与肝癌的预后有关。同时矛盾的观点也存在:认为MMP-9在肝癌组织同癌旁组织的表达无明显差异,与各临床病理特征也无明显相关性。有关sTNFRI与肿瘤相关的研究也比较多,有多项研究表明恶性肿瘤患者体液也存在高水平的sTNFRI,其灵敏度甚至高于标准的肿瘤标志物,更有研究表明sTNFRI甚至可以用来评估恶性肿瘤患者的病情.我们课题组前期的研究中也发现肝癌患者血清及腹水内存在高水平的sTNFRI,并提示可能与肝癌患者晚期免疫功能有关,可能对观察肝癌病人免疫状态具有一定的意义。于是,我们提出以下假设:肿瘤细胞膜肿瘤坏死因子受体（mTNFRI）脱落形成可溶性肿瘤坏死因子受体（sTNFRI）可能是肿瘤产生免疫逃逸的重要机制,而基质金属蛋白酶9（MMP-9）可能参与其中并起到了关键的作用。因此,稳定的mTNFRI肿瘤细胞,抑制其释放可能成为一种新的肝癌治疗的目标。目的1、组织水平:检测MMP-9在肝癌和癌旁组织的表达,同时分析相应的肝癌患者血清s TNFRI水平,并与乙型肝炎和正常对照组,以确认肝癌患者是否同时存在MMP-9和sTNFRI的高表达,并分析两者是否有关联性;同时检测TNFRImRNA在肝癌和癌旁组织中的表达情况。2、细胞水平:检测重组人MMP-9干预HepG2肝肿瘤细胞前后细胞表面TNFRI表达的变化,同时检验对应细胞上清中sTNFRI的表达量变化。意义:①揭示sTNFRI和MMP-9在肝癌中的表达及其临床意义;②明确MMP-9在mTNFRI脱落中可能存在的关键作用,探索肝癌治疗新靶点。材料和方法1.收集2007.6-2008.6来南方医院肝胆外科手术的肝癌病人肝癌及癌旁组织标本共34对,全部病例均经术后病理证实为肝细胞癌。2.从组织水平检测肝癌及癌旁组织中MMP-9的表达情况,同时检测相应肝癌病人血清sTNFRI水平,并与乙肝、正常对照组进行比较,以证实肝癌患者是否同时存在高表达MMP-9和sTNFRI,并分析两者的高表达是否存在相关性.3.从细胞水平进一步验证MMP-9和sTNFRI的相关关系1).培养肝癌细胞株HepG2,提取细胞蛋白进行RT-PCR和Western实验,分别从基因水平和蛋白水平验证肝癌细胞株HepG2中存在mTNFRI的高表达。2) MMP-9对肝癌细胞株HepG2表面TNFRI表达的影响:人HepG2肝癌细胞以2×10⁶/mL接种于直径6cm培养皿,在37℃、5%CO₂培养箱中培养12h使细胞吸附在培养板上换用无血清培养基继续培养24h后加入含有活化后MMP-9的RPMI-1640培养基（无血清）进行干预,总体积为1000μL。分组如下①MMP-90ng/mL;②MMP-9 154ng/mL;③MMP-9 3 85ng/mL;④MMP-9 770ng/mL;⑤MMP-9 1155ng/mL,干预3h;或用MMP-9 770ng/mL干预0、1.5、3、6和9h。将以上干预前、后的细胞进行细胞蛋白提取后进行Western Blotting实验验证肝癌细胞株HepG2表面TNFRI的表达情况,并将细胞培养上清用EP管分装,-20℃冰箱冻存,以备第下一步实验使用。3)细胞培养上清中sTNFRI的表达:将第三部分MMP-9干预前后冻存的细胞培养上清室温冻融,500×g离心5min后,用人sTNF-RI定量ELISA试剂盒检测上清中sTNF-RI含量。4.统计方法:实验数据以（?）±S表示,采用SPSS13.0统计软件中的one-wayANOVA、两独立样本T检验和LSD及线性相关分析进行统计学分析。结果1、肝癌组织中MMP-9在基因和蛋白水平上表达均高于癌旁组,并与肝癌的侵袭能力及是否形成癌栓正相关。但TNFRImRNA在肝癌和癌旁组织中无明显差异。2、肝癌患者血清中sTNFRI明显高于乙肝组和正常对照组,但与相应肝癌组织中MMP-9无明显的相关关系,分析可能与sTNFRI的来源比较复杂有关,需要进一步从细胞水平验证两者的关系。3、当时间固定为3h,不同浓度MMP-9对HepG2细胞TNFRI表达的影响:Westernblotting定量分析TNFRI的蛋白表达,在不同的浓度MMP-9作用3h后,MMP-90ng/mL组与MMP-9 154ng/mL组TNFRI的表达无明显差异,但MMP-9 154 ng/ml组明显高于MMP-9 385ng/mL组,MMP-9 385ng/mL组与MMP-9 770ng/mL组表达无明显差异,比MMP-9 1155ng/mL组表达高。表明MMP-9对HepG2细胞表面TNFRI表达有下调作用且与剂量有一定的关系。4、MMP-9作用不同时间后对TNFRI表达的影响:在固定MMP-9 770ng/mL浓度,不同作用时间条件下,0h组与1.5h组表达无明显差异,但高于3h组,6h组和9h组,3h组表达又高于6h,6h组与9h表达无明显差异。表明MMP-9对HepG2细胞表面TNFRI表达的下调作用与时间有一定的关系。5、当时间固定为3h,不同浓度的MMP-9作用后,HepG2细胞培养上清中sTNFRI表达量的变化:ELISA定量检测结果显示,MMP-9 0ng/mL组,sTNFRI的量为48.36pg/mL;MMP-9 154ng/mL组,sTNFRI的量为52.33 pg/mL;MMP-9 385ng/mL组,sTNFRI的量为84.17 pg/mL;MMP-9 770ng/mL组,sTNFRI的量为94.45pg/mL;MMP-9 1155ng/mL组,sTNFRI的量为142.40ng/mL。表明MMP-9促进HepG2细胞表面TNFRI脱落形成sTNFRI且与剂量有一定的关系。6、当MMP-9浓度固定为770ng/mL,MMP-9作用不同时间后细胞培养上清中sTNFRI量的变化:ELISA定量检测结果显示,0h组sTNFRI的量为48.38pg/mL;1.5h组sTNFRI的量为55.00pg/mL;3h组sTNFRI的量为79.85 pg/mL;6h组sTNFRI的量为125.64pg/mL;9h组sTNFRI的量为128.91pg/mL。表明MMP-9促进HepG2细胞表面TNFRI脱落形成sTNFRI且与时间有一定的关系。结论1、肝癌组织中MMP-9在基因和蛋白水平上表达均高于癌旁组,并与肝癌的侵袭能力及是否形成癌栓正相关。而TNFRImRNA在肝癌和癌旁组织中无明显差异。2、肝癌患者血清中s TNFRI明显高于乙肝组和正常对照组。但与相应肝癌组织中MMP-9无明显的相关关系,分析可能与sTNFRI的来源比较复杂有关,需要进一步从细胞水平验证两者的关系。3、MMP-9促进HepG2细胞表面TNFRI脱落形成sTNFRI,且有剂量和时间依赖性。MMP-9下调肝癌细胞表面TNFRI的表达,可能与肝癌侵袭转移密切相关。