丹参（SalviamiltiorrhizaBunge.）为唇形科鼠尾草属多年生草本，其干燥根和根茎是中医临床常用的一味中药，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。现代医学及药理研究表明，丹参有扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量、减慢心率、改善心肌缺氧等功效，常用于治疗冠心病、心绞痛、胸闷、心悸等症。丹参中的有效成分主要为脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类等次生代谢物，对这些次生代谢产物生物合成调控的研究有望为缓解资源短缺压力做出贡献。　　 转录因子通过与功能基因启动子序列结合，可调控次生代谢途径中多个基因的协同表达，进而调控次生代谢产物的生物合成。应用转录因子对植物次生代谢的协同调控作用促进代谢产物积累，将有可能成为今后植物次生代谢调控技术的有效手段　　 迄今，对植物转录因子功能的研究大多集中在拟南芥等模式植物中。对丹参进行的转录组测序发现多个转录因子的EST序列，GenBank数据库中收录有SmMYB4、SmPAP1和SmNF-YB三个转录因子序列，但尚未有相关功能研究报道。序列分析表明，SmMYB4和SmPAP1属于R2R3-MYB类转录因子，SmNF-YB则属于核因子Y类转录因子。与SmMYB4同源性较高的转录因子功能上与木质素生物合成相关，与SmPAP1同源性较高的转录因子则表现为对原花色素的调控。木质素、花色素与丹酚酸类化合物均属于苯丙烷类化合物。对其功能进行研究，或将有助于探索转录因子对丹参有效成分的代谢调控。　　 本文首先从丹参中克隆了这三个转录因子基因，分别进行序列分析，然后构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的遗传转化获得了转录因子基因过量表达的丹参毛状根，并检测其中次生代谢产物的含量。同时，还利用同源克隆方法获得了一个新的R2R3MYB转录因子基因——SmMYB2，并对其转录表达特性进行了研究。主要研究内容如下:　　 1.以丹参叶片总RNA反转录成的cDNA为模板，采用高保真Taq酶进行PCR扩增，获得已报道的SmMYB4、SmPAP1和SmNF-YB基因cDNA序列，并分别与GenBank中对应的基因序列进行对比分析。比对结果显示部分序列不一致，经多次PCR重复实验及测序验证，证明所克隆基因与报道序列间确有差异，可能是由于种间差异所致。　　 2.构建了丹参转录因子基因SmMYB4、SmPAP1和SmNF-YB的植物表达载体，通过发根农杆菌LBA9402介导，成功获得丹参转基因毛状根。经抗性筛选及分子鉴定，共得到载体对照组14株，SmMYB4过表达组12株，SmPAP1过表达组6株，SmNF-YB过表达组13株，共45株生长健壮基因稳定的转基因毛状根。通过荧光定量表达分析筛选出各组中相应转录因子表达量相对较高的3～4个株系用于后续实验。　　 3.对SmMYB4过表达株系苯丙烷类代谢途径相关基因进行了荧光定量分析，结果显示:4CL1、PAL2、CCR基因表达水平提高，而C3H、4CL2、C4H、PAL1等大部分基因表现为转录抑制。进一步测定丹参毛状根中酚酸类及木质素含量，丹酚酸含量变化不明显，而木质素含量降低。推测可能SmMYB4通过抑制C3H或4CL2的表达对木质素进行调控。　　 4.对SmPAP1过表达株系次生代谢相关基因进行了荧光定量分析，结果显示:SmPAP1对多数基因均表现为转录增强，平均在2倍左右。特别是与4CL1、PAL1、TAT及丹参酮类代谢途径相关的CAD、PMK、CMK、DXR、MCT、HDS、IPPI、CPS基因的转录表达水平变化表现为高度相关。次生代谢产物含量测定显示，PAP1过表达毛状根中SAB、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和花色素含量均得到显著提高，特别是丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量分别达到载体对照组的2.07倍和2.27倍。推测可能SmPAP1通过对这些基因的正调控作用促进毛状根中次生代谢物含量的提高。　　 5.SmNF-YB过表达株系次生代谢物含量未见明显影响。　　 6.采用同源克隆及GenomeWalking的方法获得一个丹参新的转录因子基因，SmMYB2（GenBank登录号:JX113685）。ORF全长795bp，编码264个氨基酸，序列比对显示属于R2R3-MYB类转录因子，与拟南芥AtMYB2同属于第二亚族。　　 7.SmMYB2组织特异性分析显示在花中表达量最高，并且随着花的发育，转录量逐渐增强;套袋实验表明，套袋强烈抑制SmMYB2及苯丙烷代谢相关途径基因的表达，推测可能SmMYB2调控丹参花的发育。同时，ABA对毛状根中SmMYB2的转录具有诱导作用，初步分析认为SmMYB2可能参与了ABA介导的防御反应。