[研究背景]化疗诱导神经病理性疼痛(Chemotherapy induced neuropathic pain CINP,简称化疗痛)是使用化疗药物常见的并发症之一,发生率高达71%-96%:其临床的特征主要表现在周围神经损伤或自主神经损伤后所产生的一系列的神经功能的紊乱症状以及体征;其病理特征主要有持续性的自发痛或间歇性灼痛、严重的痛觉超敏反应以及对正常无害刺激异常疼痛反应;是神经病理性疼痛一种常见类型之一。目前人们对化疗痛发病机制认识程度有限,临床上缺乏针对性治疗化疗痛的有效手段。因此,探索化疗痛发病机制对优化临床治疗策略具有重要的现实意义。背根神经节(Dorsal root ganglion DRG)组织是痛觉传入的初级感觉神经元胞体聚集的部位,在神经病理性疼痛的发生机制中发挥关键的作用,且与离子通道的关系密切。背根神经节组织毛细血管丰富,但是缺乏血脑屏障,因此化疗药物易在背根神经节组织内聚集并且会对组织内神经元产生毒副作用。离子通道是神经电活动的分子基础。以往的研究采用大鼠脊神经结扎(Spinal nerve ligation SNL)诱发外周神经损伤的模型,发现神经损伤后会诱发感受外界伤害刺激的神经元产生异常异位放电活动。此外,相关研究证实,背根神经节可兴奋神经元的异常异位放电与神经元细胞膜上的离子通道(包括钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道等)的表达或功能结构的改变有着密切的联系。钾离子通道K 2P 1.1编码基因为Kcnk1。研究已证实,钾离子通道的类型之一双孔钾离子通道K2P 1.1,在细胞内外钾离子在浓度梯度驱动下维持细胞膜静息电位。相关研究利用大鼠腹腔注射化疗药物紫杉醇模型,取出已经建立好的的大鼠模型背根神经节组织,研究结果提示背根神经节的神经元内钾离子通道K 2p 1.1的mRNA表达显著下调。因此,进一步深入研究背根神经节内钾离子通道K2p 1.1的基因Kcnk1与化疗痛的关系,或有望揭示化疗痛的分子机理。表观遗传修饰是指DNA的遗传序列不发生改变,但在环境刺激下遗传信息以外的其他可遗传物质会发生改变,而且这种改变可在发育过程以及细胞增殖过程中稳定的传递。表观遗传修饰的机制主要包括DNA的甲基化与去甲基化、组蛋白修饰等。S-腺苷甲硫氨酸是DNA甲基化的甲基供体,在DNA甲基化转移酶家族(DNA methyltransferases,DNMTs)的催化下,与CpG(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)双核苷酸序列中的胞嘧啶的第5位碳原子的一个甲基基团共价结合后转变为5-甲基胞嘧啶的化学反应。目前研究发现,DNMTs有3种亚型:DNMT1、DNMT3a、DNMT3b,且3种亚型均有不同的作用机理。DNMT1亚型在保护已经稳定存在的基因组上的DNA的甲基化上发挥着关键的作用,而DNMT3a亚型和DNMT3b亚型在目前比较公认的生理功能是与从头合成的甲基转移酶相一致,其主要在转化DNA的甲基化与去甲基化方面发挥作用。相关研究已经证实,过度表达的DNA甲基化通常与基因沉默有着密不可分的关系。研究发现,表观遗传修饰的常见类型DNA甲基化在肿瘤、血液系统、胚胎发育过程等相关疾病发生与发展的过程中起着非常重要的作用。TET(ten eleven translocation)甲基胞嘧啶双加氧酶家族(TETs),包括 TET1、TET2、TET3。TETs具有诱发DNA的5-甲基胞嘧啶(5-mC)氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的作用,导致DNA的甲基化转变为DNA的去甲基化。TET1和TET3在DNA甲基化与去甲基化转变的过程中起重要的作用,TET2可能参与DNA的甲基化过程。研究表明,TET1是作为一种5-甲基胞嘧啶羟基化酶,可以促进DNA启动子区域去甲基化的过程,这不仅与肿瘤、血液系统等疾病的发病密切相关,而且还可以调控胚胎干细胞的发育过程。相关研究发现,癌症的发生与表观遗传性改变有关。以往研究利用SNL模型,背根神经节微注射TET1后过表达TET1促进背根神经节神经元DNA去甲基化,脊髓背角神经元兴奋性降低。我们推测,TET1可能在化疗痛发病过程中发挥着重要作用,但其表达调控的具体机制尚不明确。因此,本课题通过建立化疗痛模型,先检测化疗痛大鼠背根神经节的Kcnk1基因甲基化水平的变化,来验证化疗痛与Kcnk1基因甲基化、去甲基化水平变化的关系;再通过背根神经节微注射HSV-TET1过表达TET1,检测过表达TET1是否能够反转这种变化,进而来验证过表达的TET1对化疗痛背根神经节内Kcnk1基因的甲基化影响。深入研究TET1与表观遗传修饰DNA甲基化之间的关系,有望揭示化疗痛的病理生理发生机制,为临床治疗化疗痛提供具有参考价值的新路径。[研究方法]1.建立化疗痛模型选用SD雄性大鼠并分为Vehicle组和紫杉醇(Paclitaxel,Pac)组(每组≥5只);Pac组每隔一天腹腔注射(第0、2、4、6天)化疗药物紫杉醇;Vehicle组腹腔注射对照溶液,注射方法与Pac组相同。2.观察化疗痛模型大鼠的行为学变化化疗痛模型建立后,Vehicle组和Pac组分别在第4、7、10天进行观察大鼠诱发痛行为,分别记录两组大鼠对机械刺激、热刺激以及冷刺激的行为学反应变化,并对记录进行统计分析。3.采用免疫荧光双标定位的实验方法观察钾离子通道K 2p 1.1在背根神经节内的不同的细胞之间的表达共定位建立大鼠化疗痛模型,取化疗痛模型大鼠L4-5背根神经节组织。本研究对所取的背根神经节组织,采用免疫荧光双标定位方法,检测K2p 1.1在背根神经节内的神经元细胞与其他细胞的表达分布。4.化疗痛大鼠模型背根神经节显微注射HSV-TET1,并分别观察大鼠行为学变化对化疗痛模型大鼠背根神经节微注射HSV-TET1分为两种方式:第一种(诱导期)是化疗痛模型建立第4天背根神经节微注射HSV-TET1,分为Naive组、Pac+HSV+TET1 组、Vehicle+HSV+TET1 组、Pac+PBS 组、Pac+HSV+EGFP 组,分别观察各组对机械、热和冷刺激的行为学变化,并对各组记录进行统计分析。第二种(维持期)是化疗痛大鼠模型建立后第7天在大鼠的背根神经节行显微注射 HSV-TET1,分为 Naive 组、Pac+HSV+TET1 组、Pac+HSV+EGFP 组,分别观察其各组对机械、热和冷刺激的行为学变化,并对各组记录进行统计分析。5.化疗痛大鼠模型的背根神经节神经元内的钾离子通道K 2p 1.1表达的变化建立大鼠化疗痛模型,取化疗痛模型大鼠L4-5背根神经节组织,对组织采用Western blot实验技术,检测在不同的时间点L4-5背根神经节神经元内钾离子通道K2p1.1表达的变化;取化疗痛模型大鼠L4-5背根神经节组织,采用免疫荧光双标染色技术,检测K2p 1.1表达改变以及在不同细胞之间表达定位;化疗痛模型大鼠L4-5背根神经节显微注射HSV-TET1,观察化疗痛模型大鼠的L4-5背根神经节过表达TET1后,观察TET1的过表达对化疗痛模型大鼠的行为学反应的影响,对实验结果进行统计学分析。6.化疗痛模型的大鼠背根神经节显微注射HSV-TET1后,检测过表达TET1对大鼠背根神经节DNA甲基化水平的变化以及对K2P1.1通道蛋白表达变化的影响构建单纯疱疹病毒HSV-TET1过表达载体。在建立化疗痛大鼠模型后第4天和第7天,分别给予化疗痛大鼠模型L4-5背根神经节显微注射HSV-TET1,按照预期时间,分别取化疗痛模型大鼠的L4-5背根神经节组织显微注射HSV-TET1的背根神经节组织,然后对各组背根神经节组织,采用Western blot技术,检测在不同的时间点的背根神经节组织神经元内钾离子通道基因Kcnk1的表达变化;取各组背根神经节组织,使用免疫荧光双标技术,观察TET1和Kcnk1在背根神经节内的细胞共定位,观察背根神经节过表达TET1与钾离子通道K2p1.1的蛋白表达改变的关系。7.化疗痛模型的大鼠背根神经节显微注射HSV-TET1后,验证过表达TET1是否通过调控Kcnk1基因甲基化来参与化疗痛建立大鼠化疗痛模型背根神经节显微注射HSV-TET1后,取过表达TET1的化疗痛模型大鼠背根神经节组织,利用Western blot技术,检测化疗痛模型大鼠背根神经节内过表达TET1与Kcnk1基因启动子之间的关联性;取过表达TET1的背根神经节组织,利用染色体免疫共沉淀法(Chromatin immunoprecipitation assay ChIP)-PCR的方法,观察化疗痛模型大鼠背根神经节神经元内钾离子通道基因Kcnk1启动子区的甲基化水平的改变,验证Kcnk1基因启动子区5-mC以及5-hmC的变化。[研究结果]1.大鼠Vehicle组和Pac组在给化疗药物前所测左右侧后足的基础阈值(机械刺激缩足反射阈值、热潜伏缩足阈值和冷刺激缩足反射阈值)均无明显差异(P>0.05)。本课题实验分别检测Vehicle组和Pac组大鼠的左右侧后足的平均值进行统计学分析提示,Pac组的大鼠在建立后的第4、7、10天分别观察大鼠的行为学反应改变,与Vehicle组进行对比,发现Pac组的大鼠的机械刺激缩足反射阈值明显较低(P<0.05)、热潜伏缩足阈值显著降低(P<0.05)、冷刺激缩足反射阈值的次数明显增加(P<0.05)。2.Pac组的大鼠在给予化疗药物后,取背根神经节组织,行Western blot分子实验技术,结果提示,Pac组与Vehicle组相比,Pac组大鼠的背根神经节内的钾离子通道K2p1.1的蛋白和mRNA的表达均显著降低。3.背根神经节不同的亚群标志物与钾离子通道K2p1.1行免疫双标染色实验技术发现,K2p 1.1阳性细胞中49.1%为NF200(中、大直径有髓纤维神经元标志物)阳性,14.1%为CGRP阳性(中、小直径多肽能神经元),25.4%为IB4阳性(小直径非多肽能神经元)。利用免疫双标染色的实验技术检测K2p1.1在背根神经节内的细胞分布发现,K2p 1.1与GS(谷氨酰胺合成酶,卫星胶质细胞标志物)几乎没有共表达,这些结果提示,在背根神经节内钾离子通道K2p 1.1的蛋白主要在神经元细胞内表达。4.化疗痛模型的大鼠的背根神经节显微注射HSV-TET1,分别观察大鼠的行为学变化,研究结果发现,化疗痛模型的大鼠过表达TET1后,其机械刺激缩足反射阈值、热潜伏缩足阈值和冷刺激缩足反射阈值均发现有显著差异(P<0.05)。这些结果均提示,化疗痛模型的大鼠的背根神经节显微注射HSV-TET1后过表达TET1,可阻断化疗药物诱导大鼠神经病理性疼痛行为学反应。5.化疗痛模型的大鼠的背根神经节显微注射HSV-TET1后过表达TET1发现,过表达TET1可调控化疗痛大鼠背根神经节DNA甲基化水平降低,而过表达TET1可诱发化疗痛的大鼠的背根神经节钾离子通道K2P 1.1蛋白的表达升高。6.染色体免疫共沉淀-PCR实验,发现在化疗痛大鼠背根神经节Kcnk1基因启动子的R1和R3区,5-mC和5-hmC存在相反的变化,表明化疗痛大鼠背根神经节Kcnk1基因内5-mC表达升高而5-hmC降低,因此,可证实,化疗痛大鼠的背根神经节Kcnk1基因的甲基化水平升高;化疗痛大鼠背根神经节显微注射TET1过表达TET1,结果提示,背根神经节过表达TET1能够减少Kcnk1基因的甲基化水平。7.化疗痛模型大鼠显微HSV-TET1过表达TET1后,取大鼠背根神经节行WestionBlot技术,检测显示,化疗痛并没有改变TET1的表达,但却下调了Kcnk1基因的表达;但是,背根神经节内TET1过表达能够反转化疗痛模型背根神经节K2p1.1蛋白表达的下降,TET1的过表达和K2p1.1蛋白表达反向变化,提示TET1过表达能够上调K2p1.1蛋白表达。[研究结论]化疗痛模型大鼠的行为学变化数据表明,大鼠的背根神经节显微注射HSV-TET1过表达TET1,能够缓解腹腔注射化疗药物紫杉醇诱导的化疗痛,而且背根神经节内的神经元的钾离子通道K2p 1.1蛋白的表达也会相应降低,进而引起神经元兴奋性的增加,可能是参与化疗痛发病的分子机制;钾离子通道K 2p 1.1蛋白的表达降低可能是由于背根神经节Kcnk1基因启动子区域的甲基化水平的增加。TET1可诱导Kcnk1基因启动子区5-mC氧化生成5-hmC,可使Kcnk1基因的去甲基化水平升高,但降低了Kcnk1基因的甲基化水平。化疗痛并没有改变背根神经节内TET1的表达,但下调了 K2p 1.1蛋白表达。然而,化疗痛模型背根神经节显微注射HSV-TET1后TET1过表达,可上调钾离子通道K 2p 1.1蛋白的表达,并缓解大鼠的化疗痛行为。因此,TET1可能是参与化疗痛的发生与发展的非常重要的因素,本课题研究TET1与化疗痛的相互联系,或许对全面阐述表观遗传修饰的发生机制有帮助,为揭秘化疗痛的分子机理提供有意义的参考,为临床治疗化疗痛开辟新的思路。简而言之,背根神经节TET1过表达调控背根神经节DNA甲基化与去甲基化水平变化的机制,可能是预防和治疗化疗痛的潜在靶点。