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背景乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一,严重影响着女性患者的身体健康。约有70%的乳腺癌患者表达雌激素(estrogen receptor,ER)或孕激素受体(progesterone receptor,PR),内分泌治疗是这种类型乳腺癌重要的治疗方法。雌激素(ER)或孕激素受体(PR)是配体依赖性转录因子核受体超家族中的一种,作为乳腺癌细胞表达的重要受体,ER在其中发挥主要作用,PR则通常被认为是促进ER功能完整表达的标志。而PR在乳腺癌内分泌治疗中的作用一直存在着争议。本实验是基于研究PR如何影响乳腺癌内分泌治疗的基础上而设计和进行的。利用RNA干扰技术沉默MCF-7细胞PR(分为PR-A和PR-B)基因表达,检测PR基因干扰前后,比较他莫昔芬(tamoxifen,TAM)对细胞(作用)的影响以及对雌激素受体(ER)、人表皮生长因子受体-2(humanepidermal growth factor receptor-2,HER-2)、蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB/AKT)表达的影响。[目 的]探讨RNA干扰技术沉默MCF-7细胞PR基因表达对TAM作用的影响及ER、HER-2、AKT表达的影响。[方 法]1.依据短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)设计原则合成针对人PR基因的4条阳性序列和阴性对照序列,设计合成4条靶向PR基因的shRNA干扰质粒以及阴性对照质粒。2.在转染试剂DNA-lipo2000的介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测转染前、后PR基因的表达,筛选出一组干扰效率最强的质粒表达载体。3.MTT实验检测TAM对乳腺癌MCF-7细胞转染组和未转染组作用的影响。4.Western blot法检测转染组和未转染组MCF-7细胞中ER、HER-2及AKT蛋白表达。5.统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析,计量样本以X±s表示两组间比较采用两独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1.shRNA质粒载体转染的MCF-7乳腺癌细胞,通过Q-PCR和Western blot检测结果显示PR-shRNA-1、3、4组转染MCF-7乳腺癌细胞中PR基因的mRNA和蛋白的相对表达量均明显低于阴性序列组与空白对照组,它们之间具有统计学差异(P<0.05),而第2组、阴性序列组与空白对照组之间无统计学差异(P>0.05)。2.MTT实验结果显示,TAM对转染组细胞以及未转染组细胞均有抑制作用,差异具有统计学意义(P<0.01);但TAM对转染组细胞的抑制作用明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,与未转染组细胞相比,转染组细胞的增殖活力明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Western blot结果显示,与未转染组细胞相比,转染组细胞的ER蛋白表达水平降低,HER-2蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05);而磷酸化AKT蛋白表达水平增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.PR-shRNA可成功地转染到乳腺癌MCF-7细胞中,且明显沉默了 PR基因的表达。2.通过干扰沉默PR基因后,TAM对MCF-7细胞的抑制作用下降,出现了 MCF-7细胞对TAM的耐药。3.通过干扰沉默PR基因,增强了 MCF-7细胞的增殖活力。4.干扰沉默PR基因影响了 ER、HER-2、AKT蛋白的表达;并且TAM对MCF-7乳腺癌细胞作用的影响可能与沉默PR基因后,ER、HER-2、AKT蛋白表达的变化有关。