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RecQ解旋酶为SF2亚家族DNA解旋酶中一个重要家族,其广泛存在于几乎所有生物体中,具有高度保守性。它是机体分子代谢途径中重要的调控蛋白,主要参与DNA复制、DNA修复、重组、转录甚至端粒稳定等分子代谢过程,对保持遗传物质的稳定性具有重要作用,人体中某些RecQ解旋酶缺失会引起疾病发生。本文以大肠杆菌RecQ解旋酶和枯草杆菌RecQ解旋酶为研究对象,通过基因克隆、蛋白表达纯化,应用生物化学和生物物理学技术(荧光偏振技术、ATPase检测技术、EMSA方法和基于FRET原理的荧光光谱法),分析测定E.coli RecQ及B.subtilis RecQ两种异构体三个野生型解旋酶的生物学活性。研究和比较大肠RecQ和枯草杆菌RecQ野生型的两种异构体及B.subtilis RecQ S锌指结构突变体的生化活性差异,探讨蛋白结构与功能的相互关系,研究结果如下：首先,通过PCR法扩增得到E.coli RecQ基因和B.subtilis RecQ基因并克隆入原核表达载体pET24a(+)中,构建了E.coli RecQ.B.subtilis RecQ L和B.subtilis RecQ S的原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达了三个野生型目的蛋白。优化表达条件后,经镍柱螯合亲和层析纯化获得纯度大于90%的可溶性蛋白。其次,应用生物化学和生物物理学技术如荧光偏振技术、ATPase检测技术、EMSA方法和基于FRET原理的荧光光谱法,分析测定E.coli RecQ及B.subtilis RecQ两种异构体三个野生型解旋酶的生物学活性。得到如下实验结果：E.coli RecQ解旋酶具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性的ATP水解活性。B.subtilis RecQ两种异构体的ATPase活性也呈现蛋白浓度依赖性。E.coli RecQ, B.subtilis RecQ S和B.subtilis RecQ L的DNA结合活性具有蛋白浓度依赖性。在等蛋白浓度下,E.coli RecQ酶结合DNA活性强弱依次为开叉dsDNA, ssDNA,平末端dsDNA。结合活性大小依次为：E.coli RecQ>B.subtilis RecQ S>B.subtilis RecQ L。RecQ解旋酶发挥解旋活性需要ATP和Mg2+的参与。三种蛋白的解旋活性呈现出蛋白浓度依赖性。在等浓度下,解旋活性大小依次为：E.coli RecQ> B.subtilis RecQ S>B.subtilis RecQ L。 B.subtilis RecQ两种异构体的DNA解旋活性均表现出3’端尾巴DNA结构>5’端尾巴DNA结构。退火活性的发挥不依赖于ATP。E.coli RecQ, B.subtilis RecQ S和B.subtilis RecQ L具有时间依赖和蛋白浓度依赖的DNA退火活性。在等浓度下,退火效率大小依次为：E.coli RecQ>B.subtilis RecQ S>B.subtilis RecQ L。再次,通过对组成B.subtilis RecQ S锌指结构的四个半胱氨酸利用重叠PCR法进行定点突变,构建得到C431G、C431R、C431A、C453R、C454S、C457G单突变体和C431G/C453R、C431G/C454S、C431G/C457G、C453N/C454N双突变体,全长突变体与野生型表达量相当,但通过变换表达载体和宿主菌多次试验均未提取到有活性的可溶性上清蛋白,所尝试的突变体蛋白都为包涵体形式表达,利用包涵体蛋白提纯和复性方法得到浓度和纯度都较高的蛋白,但多种方法复性也未能检测到活性。最后,我们进行了B.subtilis RecQ S锌指结构截断突变体的克隆表达纯化及其活性测定,发现去除锌指结构的截断突变体helicase的四大生化活性较之野生型B.subtilis RecQ S相比有所下降,进一步说明锌指结构可能在DNA结合中发挥着重要的作用。从以上结果,我们得到以下结论：1、成功获得了有生物学活性的E.coli RecQ, B.subtilis RecQ L, B.subtilis RecQ S及其锌指结构截断突变体的可溶性蛋白。2、与E.coli RecQ相比较,B.subtilis RecQ与其虽然在氨基酸序列上高度同源相似,但初步研究发现生化功能有所差异。3、缺失HRDC结构域的B.subtilis RecQ S的ATP水解活性,DNA解旋活性和DNA退火活性比其异构体B.subtilis RecQ L高,说明HRDC结构域可能对生化活性具有削弱作用。4、B.subtilis RecQ S的锌指结构对其与DNA结合和自身空间折叠起着非常重要的作用。