研究背景与目的肺癌高发且常发骨转移,易并发骨相关事件（skeletal related events,SREs）乃至恶病质而导致患者生活质量及生存期严重降低。肺癌骨转移是一系列复杂的侵袭级联过程,而转移前生态位（pre-metastatic niche,PMN）的形成在肺癌亲骨转移进程中扮演重要一环。明确PMN形成的骨微环境改变及机制对从源头阻断骨转移发生意义重大。然而目前对骨转移PMN的研究存在限制,主要是缺乏合适的研究模型。因此,肺癌骨转移PMN的研究亟需一个能模拟体内微环境及转移进程又能实现高通量监测的研究平台。微流控芯片作为新兴的肿瘤研究的有力平台,凭借其可视化、可操作性强、高通量低成本等优势有望为肺癌骨转移PMN研究提供理想的新技术平台。代谢重编程在肿瘤进展中持续存在,且是PMN形成的一个重要特征。因此,本研究拟构建肺癌骨转移仿生芯片,实现骨转移过程的可视化及监测,并与传统平台联合应用于肺癌骨转移PMN形成的骨微环境改变研究及相关代谢重编程的机制探索。方法1.微流控仿生肺癌骨转移芯片模型构建以微流控为基础构建肺癌骨转移仿生芯片模型,由“肺癌”及“骨”两个仿生器官芯片组成,上游基于图案化纳米纤维/水凝胶的微生理系统共培养LLC与L929模拟体内的肺癌的情况;“骨”芯片内引入骨片及Ⅰ型胶原实现腔室内多种细胞的三维培养以模拟骨微环境。二者连接后监测循环肿瘤细胞的轨迹以及骨微环境的改变,为肺癌骨转移研究提供合适的研究平台。2.肺癌骨转移PMN形成的体外研究获取A549及LLC细胞的条件培养基（tumor conditioned medium,TCM）分别干预成骨前体细胞、破骨前体细胞以及巨噬细胞。通过transwell探究肺癌条件培养基对成骨前体细胞迁移的影响,使用茜素红、碱性磷酸酶染色和定量分析、q RT-PCR等方法检测条件培养基对成骨分化的影响;通过q RT-PCR和Trap染色评估TCM对破骨分化的影响;通过q RT-PCR、Elisa、免疫荧光、流式细胞术等评价TCM对巨噬细胞极化的影响。3.肺癌骨转移PMN形成的体内研究通过TCM腹腔注射构建小鼠PMN模型。通过HE染色、Micro-CT评估骨质改变,以组织切片染色评估骨微环境中破骨细胞活化、成骨细胞活化程度及巨噬细胞极化比例的改变。构建股骨原位骨转移模型,以活体成像及micro-CT评估干预后肿瘤形成的情况。通过代谢组学及生信分析技术,探究PMN形成过程的代谢改变及可能的通路。结果1.成功构建肺癌骨转移的仿生芯片,实现上游肺癌细胞与成纤维细胞三维共培养,克隆增殖并释放相应的因子可以影响远隔的骨芯片。模拟了骨的结构及关键功能,为后续研究提供了有力的平台。2.TCM在体外能够促进破骨分化而抑制成骨分化,同时能招募巨噬细胞并促进其M2极化。3.成功构建裸鼠PMN模型及股骨原位肿瘤模型,TCM在体内提高破骨细胞活性及巨噬细胞的招募和M2极化,进而显著促进了骨转移的发生。TCM能够使松质骨的骨密度下降,主要表现为骨小梁的数量减少,离散程度增大。TCM干预后共有156个显著的差异代谢物,主要富集在氨基酸代谢、肿瘤中心碳代谢、AMPK等途径。结论1.本研究成功构建了肺癌骨转移仿生芯片模型,可用于肿瘤骨转移不同阶段的研究。2.肺癌分泌的因子会促进转移发生前骨生长的紊乱,表现在破骨细胞活性提升、巨噬细胞M2极化和松质骨分解代谢强于合成代谢,会促进肿瘤细胞的初始播种及后续增殖。通过代谢组学研究发现多条与PMN形成相关的通路,可能是骨微环境在转移前发生变化的重要原因,为未来肺癌骨转移提供可研究的目标,为肿瘤骨转移的预防和治疗提供新思路。