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研究目的:糖尿病是一种慢性代谢性疾病,常多发脂质代谢异常、高血压、心脑血管等并发症,并具有较高的发病率和死亡率。研究表明,糖尿病患者死亡的主要原因是长期高血糖引发的各种血管并发症,其中脑卒中在血管并发症中的发病率最高。目前对于脑卒中的主要治疗方法是溶栓,但是因治疗时间窗短,只有极少数脑卒中患者受益。内皮祖细胞可以增殖分化为成熟内皮细胞,促进损伤内皮的修复和新血管形成,并且它已经被作为脑中风预后的新标志物。近年来,干细胞移植治疗成为缺血性疾病的一种有效治疗手段。研究报道,内皮祖细胞移植治疗可以改善糖尿病心肌梗死患者的心功能,增加下肢缺血患者的血流量。研究显示,糖尿病患者外周血中内皮祖细胞数量和功能均显著降低,并伴有内皮功能障碍和血栓形成的迹象。于是我们推测,通过药物干预手段改善糖尿病内皮祖细胞功能,对于糖尿病患者自体内皮祖细胞治疗可能具有重大意义。我国传统中药丹参具有消除血瘀和缓解疼痛、躁动不安,滋养血液和安神的作用。目前,临床上有许多丹参制剂,如:丹参注射液,复方丹参滴丸等,已被广泛用于心脑血管疾病。相关报道,丹参的水溶性成分—丹参素,通过降低细胞凋亡和促进血管新生保护缺血心肌。此外,丹参素还可以保护内皮细胞（ECs）,促进小鼠缺血后肢的新血管生成和血流恢复。我们早期的研究发现,丹参素能够降低脑卒中小鼠脑缺血损伤并改善小鼠缺血后的神经行为学功能。另有报道,丹参素通过改善细胞迁移功能,提高体外血管生成能力,进而修复晚期糖基化终产物引起的EPCs功能障碍。在本课题中,我们进一步探讨丹参素防治小鼠脑缺血损伤的相关机制,研究丹参素是否通过改善糖尿病小鼠内皮祖细胞功能和增强糖尿病内皮祖细胞介导的血管新生实现的,这将为糖尿病患者自体细胞移植提供切实可行的实验依据,也为丹参素拓宽临床应用夯实基础。研究方法与结果:动物模型:（1）使用大脑中动脉电凝术制作缺血性脑卒中小鼠模型;（2）连续五天腹腔注射60mg/kg链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导Ⅰ型糖尿病小鼠模型。通过测定细胞功能（迁移、黏附、小管形成功能）观察丹参素体外干预对糖尿病内皮祖细胞功能的影响,并通过测定细胞中VEGF和BDNF蛋白表达进一步探索丹参素改善糖尿病内皮祖细胞功能的可能机制。进一步,通过内皮祖细胞治疗,观察丹参素体外干预是否增强糖尿病内皮祖细胞促血管新生作用,进而改善缺血性脑损伤。最后,观察内皮祖细胞条件培养基对缺血性脑损伤的治疗作用,探讨丹参素体外干预能否增强糖尿病内皮祖细胞的旁分泌效应。1.丹参素体外孵育显著改善糖尿病小鼠内皮祖细胞功能糖尿病小鼠造模成功后,提取正常小鼠和糖尿病小鼠骨髓EPCs,培养至第六天时,糖尿病EPCs随机分为糖尿病模型组和糖尿病给药组,糖尿病给药组细胞给予丹参素孵育24h。通过细胞黏附、迁移和小管形成功能观察各组EPCs功能变化;并采用Western blotting实验检测细胞中VEGF和BDNF蛋白表达情况。实验结果显示:与正常对照组相比,糖尿病模型组EPCs功能受损;糖尿病EPCs经过丹参素体外孵育后,其迁移、黏附细胞数以及小管形成数目,相比糖尿病模型组显著增加（P＜0.05）,而且细胞中VEGF和BDNF蛋白表达含量相比糖尿病模型组显著增加（P＜0.05）。丹参素体外孵育可以改善受损的糖尿病小鼠内皮祖细胞功能,可能与上调细胞中VEGF和BDNF蛋白表达水平有关。2.丹参素体外孵育显著增强糖尿病内皮祖细胞对缺血性脑卒中小鼠的治疗作用提取各组内皮祖细胞培养至第六天时,糖尿病给药组EPCs给予丹参素孵育24h后,收集并调整细胞浓度为5×10~6个/ml,按以下分组:（1）Vehicle组,（2）Con-Cell组,（3）STZ-Cell组,（4）STZ-DSS-Cell组,处理好的细胞立即尾静脉注射到缺血性脑卒中小鼠体内（每只注射200μl）,检测细胞注射后第一天和第三天的神经行为学功能评分和第三天时脑梗体积。按照以上分组,在细胞注射后第三天,我们用CD31标记脑损伤区周围新生血管,研究是否丹参素增强糖尿病内皮祖细胞促血管新生作用,进而改善小鼠脑缺血损伤的呢?实验结果显示:经过EPCs治疗的脑卒中小鼠脑梗体积降低,并且第一天和第三天的神经行为学功能均显著改善;STZ-Cell组与Con-Cell组比较,小鼠脑缺血损伤部位新生血管数目明显减少（P＜0.001）,卒中小鼠的脑梗体积相对较大;与STZ-Cell组比较,注射丹参素孵育的糖尿病EPCs组,小鼠脑缺血部位新生血管数目明显增加（P＜0.05）,并且脑卒中小鼠的脑梗体积明显减小（P＜0.05）。该结果表明,丹参素可能通过促进糖尿病内皮祖细胞血管新生作用,发挥对小鼠脑缺血损伤的治疗。3.丹参素体外孵育增强糖尿病内皮祖细胞条件培养基对缺血性脑卒中小鼠的治疗作用糖尿病给药组EPCs给予丹参素孵育24h后,更换EBM-2培养基,继续培养24h,收集并浓缩各组的细胞上清,分组如下:（1）Vehicle组,（2）Con-CM组,（3）STZ-CM组,（4）STZ-DSS-CM组,把浓缩上清立即尾静注到缺血性脑卒中小鼠中。考察注射后第一天神经行为学指标变化和检测小鼠脑梗体积。除此之外,我们又对改善小鼠脑缺血损伤的主要分泌蛋白进行含量测定。注射EPCs条件培养基的脑卒中小鼠脑梗体积降低,而且第一天的神经行为学功能得到改善;与Con-CM组相比,STZ-CM组卒中小鼠脑梗体积增加（P＜0.05）;经丹参素体外孵育的糖尿病EPCs条件培养基治疗组小鼠的脑损伤体积比糖尿病组明显减小（P＜0.05）。蛋白表达结果显示:与Control组比较,STZ组细胞条件培养基中TSP-1和TSP-2蛋白表达量显著增加（P＜0.001）,而VEGF和BDNF蛋白表达降低（P＜0.05）;经丹参素孵育的糖尿病EPCs,其条件培养基中TSP-1和TSP-2的表达比STZ组显著减少（P＜0.05）,但VEGF和BDNF的表达并没有显著增加。该结果提示,丹参素体外干预糖尿病内皮祖细胞,可抑制细胞分泌抗血管生长蛋白TSP-1、TSP-2,进而增强其条件培养基对缺血性脑卒中小鼠的治疗。结论:丹参素通过上调糖尿病小鼠内皮祖细胞中VEGF、BDNF的表达,改善受损细胞功能;丹参素体外孵育的糖尿病EPCs治疗缺血性脑卒中小鼠,明显改善小鼠脑缺血损伤,可能与其增强内皮祖细胞介导的血管新生和内皮祖细胞旁分泌效应显著加强有关。