内根-贝壳杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase,KO）是赤霉素（GAs）生物合成途径关键酶,也是植物GAs抑制剂多效唑的靶酶,若GAs生物合成途径在KO基因位点发生阻断,则会影响植株的正常生长。本研究以山核桃（Carya cathayensis）体细胞胚为实验材料,采用同源重组及PCR扩增技术,克隆获得山核桃KO基因及启动子序列,并进一步构建了35S::CcKO::GFP过表达载体和CcKOpro::GUS启动子表达载体;之后利用BLAST在线工具对该基因的氨基酸序列进行同源性分析及生物信息学分析;然后利用农杆菌介导法将过表达载体及启动子表达载体转入核桃体细胞胚并进行植株再生,从而获得阳性再生植株,并深入解析山核桃KO的生物学功能,旨在利用生物技术手段从基因水平调控山核桃的生长发育,为山核桃矮化/半矮化新种质的分子辅助育种提供理论依据。本研究主要结果如下:1.山核桃CcKO基因的克隆:通过克隆获得一条山核桃CcKO开放阅读框,其全长为1563 bp,共编码520个氨基酸,相对分子量为59.076 kD。氨基酸同源性分析表明,山核桃CcKO含有细胞色素P450核心功能域FXXGXRXCXG和氨基端的跨膜结构域。BLAST结果表明,山核桃CcKO氨基酸序列与核桃JrKO氨基酸序列同源性为96%,与银白杨、梨、苹果、板栗的氨基酸同源性分别为74%、71%、72%、77%。2.山核桃KO基因及启动子遗传转化体系的构建:（1）对核桃成熟体胚进行不同脱水时间处理,发现随着脱水时间延长,萌发率呈现先升后降的趋势,并在脱水8 d后,体胚的萌发率最高,达到78.33%;qPCR检测结果表明,随着脱水时间的延长,核桃脱水素基因Jr DHN的表达量逐渐升高,复水后该基因的表达量迅速下降。不同抗生素种类和浓度对农杆菌介导的遗传转化结果表明:300 mg/L的羧卞青霉素能够有效抑制农杆菌的生长,并促进体胚增殖。（2）山核桃KO基因及启动子的遗传转化:启动子表达经GUS染色和PCR验证表明,CcKOpro::GUS启动子表达载体成功转入核桃体细胞胚中,且E1代体胚GUS阳性率为30%,E2代体胚GUS阳性率为50%,E3代体胚GUS阳性率为70%,将获得的阳性体胚培养成植株,鉴定再生植株的阳性率为75%;过量表达经荧光检测显示及PCR验证表明,35S::CcKO::GFP过表达载体被成功转入核桃体细胞胚中,体视荧光显微镜下可以观察到体胚的发育经历了球形胚、心形胚、鱼雷胚以及子叶胚阶段,且E1代GFP阳性率为46%;E2代GFP阳性率为65%;E3代GFP阳性率为83%,将获得的阳性体胚培养成植株,鉴定再生植株的阳性率为62.5%。3.山核桃CcKO基因的表达及生物学功能分析:qPCR结果表明,山核桃CcKO基因表达具有组织特异性,其中茎中表达量显著高于其它组织部位;表型及相关分析结果显示,山核桃CcKO基因过表达再生植株株高显著高于对照,说明该基因表达量与植株株高呈正相关;过量表达可使核桃阳性再生植株GAs合成通路下游GA20ox表达量升高而GA2ox表达量下降。启动子GUS定位及相关分析显示该基因主要定位于维管束中,通过结合MYB转录因子调控组织代谢和细胞生长,进而调控植物的生长发育。本研究结果为进一步分析KO基因在胡桃科植物生长发育过程中的作用提供了理论基础,也为胡桃科植物中研究GAs合成的其他关键酶提供技术参考。