为研究新型、安全、环保的抗生素替代品,本研究以前期筛选出的具有高效抗菌抗病毒活性的杂合肽CecropinA(1-8)-LL37(17-30)(简写为C-L)为研究对象,采用扫描电镜、透射电镜、DNA凝胶电泳和Tricine-SDS-PAGE电泳等手段,通过研究C-L与细菌潜在作用靶标(细胞膜、DNA和蛋白质)之间的作用来探索其抑菌机理以及与常用抗生素的协同关系。结果表明,C-L主要作用于大肠杆菌CVCC245和金黄色葡萄球菌ATCC25923的细胞膜,通过“细胞膜孔洞形成”,进而导致细胞质外溢的方式杀灭细菌,而对细菌DNA、蛋白质的合成无影响,这与母源肽(Cecropin A(C)和LL37(L))的抑菌机理一致。C-L与5种常用抗生素(氯霉素、硫霉素、新霉素、青霉素和卡那霉素)的协同试验结果表明,对大肠杆菌CVCC245,C-L与新霉素、氯霉素联合分别呈现出完全协同(FIC<0.5)和部分协同(0.5<FIC≤1)的作用;而对于金黄色葡萄球菌ATCC25923,它与氯霉素、硫霉素和新霉素之间具有完全协同作用(FIC<0.5),与卡那霉素联合之间具有部分协同作用(0.5<FIC≤1)。上述结论说明C-L不易产生耐药性,与抗生素联合使用可增强抑菌效果、减少抗生素的治疗用量并能提高应用安全性。为获得高活性的重组杂合肽C-L,本研究首先选择大肠杆菌表达系统对其进行重组融合表达。根据C-L氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏好性,设计并合成C-L基因序列,而后与pETSUMO载体通过“TA克隆”连接,构建重组表达载体pETSUMO-C-L,经PCR、测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建大肠杆菌重组表达工程菌BL21-pETSUMO-C-L。在1.5mMIPTG诱导下,SUMO-C-L在大肠杆菌胞内实现了融合表达,其中在诱导5h时表达量最高,达 89.14mg/L。SUMO-C-L 经 SUMO 酶特异性酶切和 Ni-NTA Sepharose 纯化后,获得了 17.54mg/L重组杂合肽C-L。抑菌试验结果表明,重组杂合肽C-L具有与化工合成C-L相似的抗菌活性、较宽的pH耐受范围(5～12)和极好的温度热稳定性。但是在试验中发现,大肠杆菌表达系统表达量低、分离纯化工艺复杂且成本高(酶切融合蛋白所用的SUMO-protease费用高),不利于规模化生产,为此本研究又采用毕赤酵母表达系统对杂合肽C-L进行重组分泌表达。首先,根据C-L氨基酸序列及毕赤酵母密码子偏好设计并合成C-L基因序列,而后克隆到表达载体pPICZαA中构建重组表达质粒pPICZαA-C-L,经PCR、测序验证后,电转化毕赤酵母GS115构建重组表达工程菌GS115-pPICZαA-C-L。在0.5%甲醇诱导下,重组杂合肽C-L在发酵上清液中分泌表达成功,其中在诱导96h时表达量最高。经Ni-NTA Sepharose纯化后,每升发酵液中可获得190.65mg重组杂合肽,显著高于大肠杆菌系统表达量。抑菌试验结果表明,重组杂合肽C-L具有与合成杂合肽C-L相似的抗菌活性、较宽的pH耐受范围(5～12)和极好的温度热稳定性。本研究一方面丰富了杂合肽理论,另一方面为抗菌抗病毒杂合肽的重组表达、分离纯化和特性研究提供了一套方法,为其产业化提供了理论依据。