近年来，肿瘤基因治疗研究的一个热点为评价载体及治疗基因的转染效率和安全性。虽然临床前的动物实验可以通过尸体剖验的方法，获得一些生物分布的信息，但尚缺乏检测治疗基因在人体内表达的药物动力学和生物分布的方法。近来PET的无创伤性基因显像用于小动物实验取得了成功。该基因显像又称为报告基因显像，是将报告基因与治疗基因结合，针对报告基因制备一种放射性核素探针，然后进行PET显像，通过报告基因的检测，间接地反映治疗基因在体内的表达及其生物分布。这种显像优势在于只要报告基因与治疗基因的表达有固定的相关性，报告基因显像可以用于检测所有的治疗基因。 单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV1-TK）基因是目前PET基因显像研究中最有效的报告基因。用于HSV1-TK基因PET显像的核素探针有放射性核素标记的嘧啶核苷类似物，如5.124I-iodo-2-fluoro-2-deoxv-1-β-D-arabino-5-iodouracil（124I-FIAU），以及放射性核素标记的无环鸟苷的衍生物，如9-（4-18F-fluoro-3-]hydroxymethyl]butyl）guanine（18F-FHBG）。研究表明18F-FHBG具有稳定性好、从血液中清除快、本底信号低、安全等特性，是很好的HSV1-TK报告基因PET显像的探针，可用于人类基因治疗的临床监测。作为一种敏感的、特异的、安全的基因探针已经被美国食品与药品管理局批准为临床实验用药。本研究建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用重组逆转录病毒载体将HSV1-TK基因导入肿瘤细胞，然后进行18F-FHBG PET显像，为监测治疗基因在活体内的表达情况奠定基础。　　实验目的： 本课题研究目的为选择人端粒酶逆转录酶（hTRET）作为肿瘤治疗的靶基因，采用逆转录病毒载体作为转导手段，实施双链RNA干扰技术（siRNA），使活化的端粒酶逆转录酶静寂、敲低，达到治疗恶性肿瘤的目的。同时使用PET进行HSV1-TK报告基因显像，以检测目的基因在荷瘤裸鼠体内转导的效果。　　 实验方法：　　 1.构建表达hTERT-siRNA的逆转录病毒表达载体。 根据人端粒酶逆转录酶mRNA编码序列，设计RNA干涉靶点，构建siRNA表达载体。采用PCR法分别扩增HSV1-TK序列、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的DNA序列、U6启动子序列和hTERT-siRNA对应的DNA序列，随后按照增强型绿色荧光蛋白或HSV1-TK、U6启动子和hTERT-siRNA的顺序，将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中，得到两种重组质粒pLXSN-EGFP-U6-siTERT、pLXSN-TK-U6-siTERT。通过限制性内切酶对重组表达载体进行鉴定。采用磷酸钙共沉淀法制备重组逆转录病毒，经包装细胞293Ampho产生重组逆转录病毒并测定病毒滴度。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的抑制效果。　　2.PET检测报告基因TK在裸鼠移植肿瘤内的表达。 采用自动合成法制备18F-FHBG基因探针；建立人肝癌BEL-7402细胞裸鼠双侧腋窝稍靠背侧皮下移植瘤模型。当裸鼠移植瘤体积≥200mm3时，在8只裸鼠中选取5只，以裸鼠右侧腋窝移植肿瘤作为实验组肿瘤，向肿瘤内注射表达-TK-U6-siTERT基因的逆转录病毒（5×105pfu/ml）0.2ml；注射方法为肿瘤中心及周围四点，共5点分散注射，连续注射三天。以裸鼠左侧腋窝移植肿瘤为对照组肿瘤，未进行任何处理。经裸鼠尾静脉注入18F-FHBG 150MBq（0.2ml），麻醉裸鼠，分别于注射18F-FHBG后10min、30min、50min、70min、90min、110min、130min、150min、170min、190min、210min进行PET显像，发射扫描5分钟/床位。放射性摄取值的计算通过沿病灶或组织脏器的周边勾画感兴趣区（ROI），由计算机自动计算出摄取值，单位为KBq/cc，取平均值。　　 3.hTERT-siRNA治疗人肝癌裸鼠移植瘤的疗效观察。 建立人肝癌BEL-7402裸鼠右侧腋窝稍靠背侧皮下移植瘤模型，选取15只体积接近平均值的裸鼠随机分为3组：试验组、阴性对照组和空白对照组，每组5只。试验组裸鼠肿瘤内注射表达TK-U6-siTERT基因的逆转录病毒；阴性对照组裸鼠肿瘤内注射逆转录病毒空载体；空白对照组未经任何处理。测量肿瘤体积，相对肿瘤体积（RTV）=Vt/V0。其中V0为分组给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。绘制肿瘤生长曲线：以时间（天）为横坐标，以RTV为纵坐标。给药后观察5周，第36天处死裸鼠，取出瘤体、称重、量大小并照相；每组的肿瘤体积取平均值，在此基础上进行体积抑瘤率的计算。抑瘤率=（空白对照组平均RTV-治疗组平均RTV）/空白对照组平均RTV×100％。肿瘤组织常规苏木素-伊红染色（HE）及凋亡检测。凋亡指数（apoptosis index，AI）=（调亡细胞数/肿瘤细胞总数）×100％。　　 实验结果：　　 1.构建表达hTERT-siRNA的逆转录病毒表达载体。 限制性内切酶酶切结果表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的siRNA的两种逆转录病毒表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT和pLXSN-TK-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒，经病毒滴度测定表达EGFP-U6-siTERT、TK-U6-siTERT的逆转录病毒滴度分别约为6×105、5×105。表达EGFP-U6-siTERT重组逆转录病毒感染人Hela细胞，24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1％；重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时MTT实验测得细胞死亡率为53.2％。　　 2.PET检测报告基因TK在裸鼠移植肿瘤内的表达。 18F-FHBG未校正放化产率为4～10％，经放射性HPLC分析测定放化纯度大于95％。PET显像结果表明，对照组移植瘤放射性分布未见明显增高；实验组移植肿瘤于注射18F-FHBG后50min～210minPET显像见到肉眼可分辨的放射性浓聚，放射性摄取值逐渐升高，150min达到高峰（摄取值为19.772 KBq/cc），此后放射性摄取值逐渐下降。实验组移植瘤的放射性摄取值明显高于对照组移植瘤，在150min时实验组移植瘤摄取值/对照组移植瘤的比值达到峰值4.99。　　 3.hTERT-siRNA治疗人肝癌裸鼠移植瘤的疗效观察。 肿瘤生长曲线显示阴性对照组和空白对照组的裸鼠肿瘤持续增长，体积明显变大，至观察期结束（第36天），RTV分别为（4.91±1.93）、（3.93±1.46），二者差异无显著性（P>0.05）。而试验组裸鼠肿瘤增长至第16天达高峰，RTV为（1.95±0.66），此后体积逐渐下降。观察期结束（第36天），RTV的平均值为（1.23±0.73）。试验组的RTV明显小于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。计算得实验组的抑瘤率为73.05％，阴性对照组的抑瘤率为-2.4％。病理学检查结果HE染色，可见阴性对照组和空白对照组肿瘤细胞生长良好，肿瘤形态不规则，大小不一，核染色质多，核膜厚，不规则，可见较多病理性核分裂相，异型性明显；而试验组大部分肿瘤细胞结构消失，可见细胞崩解成碎片。TUNEL染色标本镜下显示，凋亡细胞核呈黄色或棕黄色，可伴有细胞质不同程度着色，浓缩的细胞质紧贴于核膜，核固缩成一致密物。各组肿瘤组织凋亡指数分析：试验组凋亡指数为（0.776±0.089）；阴性对照组凋亡指数为（0.034±0.020）；空白对照组凋亡指数为（0.027±0.015）。三组凋亡指数的方差分析（方差不齐P=0.006；采用近似F检验Welch法分析）：三组凋亡指数有显著性差异（P=0.000）。多重比较（Dunnett’T3法）：试验组与空白对照组、试验组与阴性对照组之间有显著性差异（P=0.000；P=0.000）；空白对照组与阴性对照组之间无显著性差异（P=0.885）。 结论： 1、本课题选择人端粒酶逆转录酶作为肿瘤治疗的靶点，以限制端粒酶活性为目标，这一肿瘤基因治疗策略比以往单纯针对某个癌基因治疗具有更广阔的临床应用前景。作为一种广谱的基因治疗恶性肿瘤的探索性研究，本研究成功地构建了针对人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT及pLXSN-TK-U6-siTERT。 2、本研究成功地制备了18F-FHBG基因探针，建立了人肝癌BEL-7402裸鼠皮下移植瘤模型，并将逆转录病毒。pLXSN-TK-U6-siTERT转染肿瘤细胞，进行PET报告基因显像。PET显像表明，18F-FHBG具有稳定性好、从血液中清除快、本底信号低等特性，是很好的HSV1-TK报告基因PET显像的探针；实验组肿瘤的放射性摄取值明显高于对照组肿瘤。因此，这一报告基因显像系统可以用于检测目的基因在荷瘤裸鼠体内转导的效果。 3、体内、外抑瘤实验表明选择人端粒酶逆转录酶作为肿瘤治疗的靶基因，采用逆转录病毒载体作为转导手段，实施双链RNA干扰，使活化的端粒酶静寂、敲低，该方法可以明显遏制恶性肿瘤的生长。