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稀有糖是自然界中含量极少的一类单糖及其衍生物,因具有独特的生理生化特性,在食品和制药领域得到广泛的应用。其中D-阿洛酮糖、D-阿洛糖两种稀有糖的甜度分别是蔗糖的70%和80%,能量几乎为零,而且安全无毒副作用,此外两者所具有的独特生理功能也使之在甜味剂和保健品等领域应用潜力巨大。然而,稀有糖在自然界存在极少,提取困难,现有的化学方法合成具有诸多限制,因此生物转化法合成稀有糖受到了广泛的关注。根据Izumoring策略,D-阿洛酮糖可由廉价易得的D-果糖为底物通过酮糖3-差向异构酶催化生成,D-阿洛酮糖进一步经L-鼠李糖异构酶催化生成D-阿洛糖,酮糖3-差向异构酶和L-鼠李糖异构酶是合成D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的关键酶。本论文挖掘并鉴定了5种具有催化D-果糖生成D-阿洛酮糖功能的酮糖3-差向异构酶,并解析了其中两种酶的单体结构及其与不同底物的复合体结构,并基于结构解析进行了功能改造研究;同时鉴定了两种具有催化D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖功能的L-鼠李糖异构酶,并解析了两者的单体结构及其耐热机制。主要结论如下。（1）成功挖掘了5种具有催化D-果糖生成D-阿洛酮糖功能的酮糖3-差向异构酶新基因,分别是来源于Sinorhizobium fredii CCBAU 83666、Staphylococcus aureus、Agrobacterium sp.SUL3和Halanaerobium congolense的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAE:Sf DAE、Sa DAE、a DAE和Hc DAE）和来源于Sinorhizobium sp.RAC02的D-塔格糖3-差向异构酶（s DTE）,成功实现了在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化精制,并在此基础上对5种酮糖3-差向异构酶的酶学性质进行研究,发现其最适p H分布于7.5～8.0之间,最适温度介于50°C～70°C之间,其中Sf DAE在这5种酶中的温度稳定性最好。5种酶均为严格的金属离子依赖性酶,Sf DAE、Sa DAE、Hc DAE和a DAE的最适反应金属离子是Mg2+,而s DTE的最适反应金属离子是Mn2+。（2）通过X-射线晶体衍射获得了Sf DAE单体结构及其与四种不同底物的复合体结构,以及a DAE单体结构及其与D-果糖和D-阿洛酮糖的复合体结构的衍射数据,并进行了数据的解析和精修,最终获得了高分辨率的单体及复合体结构,Sf DAE单体结构及其与D-果糖、D-阿洛酮糖、D-塔格糖和D-山梨糖复合体结构的分辨率分别为1.55（?）、1.70（?）、1.80（?）、2.10（?）和1.88（?）。a DAE单体结构及其与D-果糖和D-阿洛酮糖复合体结构的分辨率分别为2.05（?）、2.12（?）和2.32（?）。通过对Sf DAE的蛋白结构分析,发现在Sf DAE晶体结构中,存在的具有开关状态的一段α-螺旋（α’8）,为Sf DAE的盖子结构,Sf DAE在结合底物后,盖子结构覆盖了活性中心,同时氨基酸M15远离了活性中心。通过对盖子氨基酸序列的删减、替换和突变等一系列的实验改造,证明了盖子对DAE家族蛋白发挥催化活性具有重要的作用。此外,Sf DAE、a DAE两种蛋白与D-阿洛酮糖之间的相互作用要比与D-果糖之间的相互作用多一个氢键,这也是DAE家族对D-阿洛酮糖的亲和性高的原因。（3）基于Sf DAE的晶体结构的解析及改造,获得了热稳定性提高的突变体,突变体M15K和A254C的熔解温度（Tm值）与野生型相比分别提高了3.5°C和2.5°C。其双突变体M15K/A254C的Tm值比野生型提高了5.5°C。同时对Sa DAE和Hc DAE进行了结构模拟与分子改造,并获得了性能提高的突变体。其中,通过对Sa DAE序列分析和定点突变,获得的突变体V105A对D-果糖的催化活性提高了68%,且三突变体S209C/S188D/M190F的Tm值比野生型提高了7.2°C;通过对Hc DAE的底物结合位点进行饱和突变,并在亚基界面之间介入了分子间二硫键,分别获得了催化活性和温度稳定性都提高的突变体,其中突变体Y7H/C66L/I108A对D-果糖的相对活性是野生型的3.45倍,介入二硫键的突变体K260C/R156C的Tm值提高了3.5°C,而最终的五突变体K260C/R156C/Y7H/C66L/I108A在70°C下的半衰期(t1/2)和Tm值分别为6.3 h和79.5°C,与野生型相比分别提高了5.2 h和6.5°C。（4）研究了来源于嗜热菌株Dictyoglomus turgidum DSM 6724和Thermotoga maritima MSB8的L-鼠李糖异构酶（LRI:Dt LRI和Tm LRI）的酶学性质,结果表明Dt LRI的最适p H和温度分别是8.0和70°C;Tm LRI的最适p H和温度分别是8.0和80°C;Dt LRI和Tm LRI的Tm值分别为57.5°C和75.5°C,Tm LRI的温度稳定性高。（5）通过X-射线晶体学获得了Dt LRI和Tm LRI的晶体结构,其分辨率分别为2.90（?）和2.74（?）。基于两者的结构分析,阐释了Tm LRI的耐热机制。Tm LRI序列中的丙氨酸、脯氨酸、精氨酸和谷氨酸的含量要高于Dt LRI和来源于Bacillus halodurans的LRI（Bh LRI）,这些氨基酸有助于提高酶的温度耐受性。另外耐热酶的N-末端和C-末端通常会与周围的氨基酸相互作用,在高温下维持稳定的构象而不被降解。Bh LRI和Dt LRI结构中的N端与Tm LRI的N端相比,有一段额外的α-螺旋（α0）,其B-因子较高,删除Dt LRI的N端α0序列后,Dt LRIΔN的Tm值为62.5°C,与野生型相比提高了5°C。