视网膜神经元变性是视网膜色素变性、老年黄斑变性、视网膜脱离等常见眼病造成视力损害的原因。移植体外培养的神经干/前体细胞到病变损害的视网膜，取代变性的视网膜神经元，是治疗这一类型视网膜病变的有希望的途径之一。移植的神经干/前体细胞发挥功能的前提是移植细胞能够从移植部位迁移到病变或损伤的部位。譬如，移植到玻璃体腔的神经干细胞必须能够从玻璃体腔向视网膜内迁移，并且穿透视网膜组织的各个屏障，比如内界膜，才有可能到达病变部位，与视网膜神经元建立结构和功能上的联系，整合到视网膜神经元环路，进而进一步分化为成熟神经元并发挥功能。近年来研究表明，神经干/前体细胞移植到大鼠玻璃体腔或视网膜下腔后，能够准确地迁移到遭受病变损伤的部位。GrozdanicSD等把成年海马回神经干/前体细胞移植到新生或成年大鼠眼玻璃体腔，发现移植细胞能够存活一定的时间并且一部份细胞能整合到宿主视网膜的板层结构。然而，同时又发现，神经干/前体细胞移植到成年动物眼内时，只有在视网膜病变或受到损伤时，才出现广泛的迁移和整合。这些研究提示，病变或损伤组织可能生成了某些细胞因子，为外来的神经干前体细胞迁移到病变部位提供了某种“信号”，引导供体细胞向病变组织迁移。但损伤组织产生的这种指导移植细胞向病变部位迁移的细胞因子的性质是什么目前尚不清楚。 在损伤组织分泌的多种细胞因子中，基质细胞衍生因子(stromalcells-derivedfactor，SDF-1)目前被认为是最有可能引导干细胞迁移的一个。SDF-1最先被发现是白细胞、造血细胞及血管内皮细胞的趋化剂，最近的研究发现SDF-1在调控胚胎发育过程中神经干/前体的迁移以及肿瘤细胞的转移中也起着至关重要的作用。为了证明SDF-1-CXCR4功能轴是否参与了指导移植细胞向受体视网膜病变部位迁移这一过程，本实验检测了SDF-1在三种损伤机理截然不同的视网膜损伤模型中的表达与时空分布特点。同时，为了证明SDF-1发挥作用的另一基础，即CXR4(SDF-1的唯一受体)是否存在于供体细胞，我们检测了体外扩增的视网膜前体细胞上CXCR4的表达情况，并且检查SDF-1对视网膜前体细胞的体外趋化作用。本研究证实，视网膜在经受各种不同的损伤/病变时均产生炎症趋化因子SDF-1，但在不同的损伤模型中有不同的时空表达特征。同时，体外扩增的视网膜前体细胞表达SDF-1的受体CXCR4，并且对SDF-1的趋化反应能力呈剂量依赖关系。这些实验说明，SDF-1-CXCR4通路是指导移植细胞向病变部位迁移的途径之一。实验进一步证实，视网膜前体细胞在O2诱导下CXCR4受体表达增加，提示视网膜前体细胞移植到体内后对SDF-1的趋化能力可能增强。 本研究分为以下四个部份： 第一部分SDF-1在损伤/病变的视网膜上的表达研究 目的：探讨SDF-1在急性损伤和遗传性视网膜变性损伤大鼠视网膜上的表达及时空分布特征。 方法：60天S-D大鼠37只，随机分为缺血再灌注组(16只)、N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)损伤组(16只)、和对照组(5只)。MNU损伤组腹腔注射MNU60mg/kg体重一次，建立MNU诱导的大鼠视网膜损伤模型。缺血-再灌注损伤组前房110mmHG静水压持续60分钟建立视网膜急性缺血-再灌注损伤大鼠模型。MNU损伤模型1d，3d、5d和7d后取材，缺血再灌注损伤大鼠再灌注后6小时、12小时、24小时和48小时取材。遗传性视网膜变性RCS大鼠分为25天和50天组各10只，正常RCS鼠5只作为对照。末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法(TUNEL)染色检测不同时间点模型鼠凋亡细胞的分布。RT-PCR检测以上各时间点视网膜组织SDF-1和低氧诱导因子(Hypoxiainduced-factor，HIF-1)mRNA的表达，免疫组织化学法检测SDF1蛋白在视网膜的表达。 结果：对照组未见TUNEL标记的阳性细胞。MNU作用1天后，视网膜外核层出现凋亡细胞，3天时增加最明显。SDF-1mRNA的表达量在第3天达到高峰，SDF-1表达主要集中在视网膜外核层。视网膜缺血-再灌注损伤12小时后视网膜内层出现TUNEL阳性细胞，24小时数量最多，SDF-1mRNA的表达量在24小时达到高峰。HIF-1mRNA在损伤后24小时表达量最高。SDF-1首先出现在视网膜内层小血管周围，以后在视网膜内层扩散。25天和50天组RCS鼠视网膜均检测到SDF-1mRNA，25天时表达高于50天。 结论：视网膜损伤时病变组织产生SDF-1，不同类型的损伤SDF-1表达持续时间不同。视网膜缺血-再灌注损伤时，SDF1表达可能受低氧诱导因子HIF-1的调控。 第二部分全神经球贴壁培养法体外扩增视网膜前体细胞 目的：视网膜前体细胞是视网膜移植的理想供体来源，本研究的目的是探寻一种既高效又能连续体外扩增视网膜前体细胞(RetinalProgenitorCells，RPCs)的培养方法。 方法：E17天小鼠胚胎视网膜细胞采取神经球贴壁培养或直接贴壁培养法。神经球贴壁培养时，先经悬浮培养生成富含前体细胞的神经球，然后将700rmp/min离心分离出的神经球接种到Poly-D-Lysine包被的培养瓶，在前体细胞培养液中(含FGF-2、EGF和LIF)贴壁培养，头24小时在培养液中添加10％的胎牛血清。直接贴壁培养法是将细胞悬液直接接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶培养。撤除前体细胞培养液中的分裂原，加入10％的胎牛血清和1uM的视黄酸诱导分化7天。细胞免疫组织化学和FACS分析神经球贴壁培养细胞的干细胞特性和分化能力，并与直接贴壁培养法得到的细胞进行比较。 结果：神经球接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶后贴附到培养瓶底，神经球周边的细胞逐渐向外周延伸，留下扁平的细胞体，逐渐形成贴壁生长的单层细胞。该法能够在体外长期扩增视网膜前体细胞，6个月内细胞能够传代10次以上。在RA诱导分化时，能够生成成熟视网膜细胞，表达视网膜细胞特异性标记。FACS分析和免疫组化染色显示神经球贴壁培养所得细胞在未分化时Nestin阳性率(92％)细胞率以及分化为成熟视网膜细胞的比率(53.7％)，均高于直接贴壁培养法获得的细胞。 结论：神经球贴壁培养法能够在体外长期大量扩增视网膜前体细胞，能较好地保持干细胞特性，并容易分化为成熟的视网膜细胞，较直接贴壁培养具有较大的优越性。 第三部分SDF-1对视网膜前体细胞的体外趋化作用 目的：分析体外培养的RPC上趋化因子受体CXCR4的表达以及其配体SDF-1对RPC的趋化作用。 方法：利用RT-PCR检测神经球贴壁培养法获得的RPC上CXCR4受体mRNA的表达，荧光激活细胞分类法(Florescent-activatedcellssort，FACS)测定CXCR4阳性细胞率。激光共聚焦显微镜检查CXCR4受体在RPC上的表达。Boyden小室实验观察0ng，40ng，60ng，100ng/ml浓度SDF-1对RPCs的趋化作用；划痕试验观察SDF-1对RPC增殖和迁移的影响。 结果：RPC分化前后均表达CXCR4mRNA，FACS表明CXCR4阳性细胞数占RPC总数的20％左右。SDF-1对RPCs的趋化作用在一定范围内随SDF-1浓度的增加而增加。用Anti-CXCR4抗体封闭RPC上的CXCR4受体，SDF1对其趋化作用消失。划痕实验显示SDF-1促进RPCs的增殖和迁移。 结论：体外扩增的视网膜前体细胞表达功能性CXCR4受体，SDF-1对CXCR4阳性RPC有趋化作用，趋化效率与SDF-1浓度呈剂量依赖关系。 第四部分缺氧诱导增加视网膜前体细胞表达CXCR4受体 目的：CXCR4及其配体SDF-1组成的趋化轴在指导视网膜前体细胞向病变部位定向迁移的过程中可能起重要作用。增加RPC的CXCR4的表达率有可能增强干细胞的趋化活性，从而提高移植细胞的定向迁移能力。考虑到干细胞移植到玻璃体腔或视网膜下腔后面临的O2浓度远低于体外培养环境，因此本文探讨RPC在低氧培养时CXCR4受体表达情况。 方法：FACS检测10％O2浓度培养24，36h和48h小时后，RPC中CXCR4阳性细胞百分比，RT-PCR检测CXCR4和HIF-1和mRNA的表达。Boyden小室实验观察60ng/ml的SDF-1对低氧培养不同时间的RPC的趋化效率。 结果：FACS检测表明，低O2培养24，36h和48h小时后RPC中CXCR4阳性细胞率分别为19.6％、26.9％和46.1％，统计学分析差异有显著性。在正常O2培养时未能检测到HIF-1mRNA的表达，但低O2培养后HIF-1mRNA表达逐渐升高。Boyden小室实验发现60ng/ml的SDF-1对低氧培养不同时间的RPC趋化作用增强。结论：视网膜前体细胞在低氧条件下CXCR4受体表达增加，同时对SDF-1的趋化反应能力增强。HIF-1表达增加是CXCR4表达增高的可能机制。