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小麦赤霉病是造成小麦减产甚至绝产的一种世界性真菌病害,在全世界各小麦种植区均有发生。近年来,随着用药时间的延长与用药剂量的增大,赤霉病菌病原群体已对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性,且抗药性比例逐年增高、抗药性范围逐年扩大,病害防效显著降低。杀菌剂市场中陆续出现了琥珀酸脱氢酶抑制剂类（succinate dehydrogenase inhibitors,SDHIs）和甲氧基丙烯酸酯类（quinone outside inhibitors,QoIs）等新型呼吸抑制剂类杀菌剂。南京农业大学杀菌剂生物学实验室前期研究发现,甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯虽对小麦赤霉病具有较好的防治效果,但能刺激小麦赤霉病菌脱氧雪腐镰孢菌烯醇（DON）毒素合成,加剧麦粒中DON毒素污染。基于上述研究结果,QoIs杀菌剂的不同品种是否都存在防治小麦赤霉病加剧毒素污染所导致的食品安全问题,及QoIs杀菌剂对DON毒素生物合成的分子调控作用成为国内外十分关注的重要科学问题。本文利用菌丝生长抑制法及孢子萌发抑制法,分别测定了吡唑醚菌酯、丁香菌酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、嘧菌酯和烯肟菌胺等6种QoIs杀菌剂对32株赤霉病菌的抑菌活性。结果显示,在抑制菌丝生长方面,吡唑醚菌酯、烯肟菌胺、啶氧菌酯、丁香菌酯、氟嘧菌酯和嘧菌酯对32株赤霉病菌的EC50值变化范围分别为0.0492-0.1557μg/mL、0.0199-0.4158 μg/mL、0.0532-0.5093 μg/mL、0.0433-0.9855 μg/mL、0.2680-1.7754μg/mL、0.2739-1.2403 μg/mL;平均 EC50值分别为 0.0859 μg/mL、0.1115μg/mL、0.1220 μg/mL、0.2902 μg/mL、0.8413 μg/mL、0.9663 μg/mL。在抑制孢子萌发方面,啶氧菌酯、吡唑醚菌酯、烯肟菌胺、丁香菌酯、嘧菌酯和氟嘧菌酯对32株赤霉病菌的 EC50值分别为 0.0642-0.1352 μg/mL、0.0379-0.1953 μg/mL、0.0784-0.2509μg/mL、0.0810-0.3518 μg/mL、0.2065-1.8422 μg/mL、0.2453-1.9818 μg/mL;平均 EC50值分别为 0.0940 μg/mL、0.0948 μg/mL、0.1248 μg/mL、0.2149 μg/mL、0.6101 μg/mL、0.9260 μg/mL。上述结果表明,QoIs杀菌剂对赤霉病菌菌丝生长及孢子萌发均具有较强的抑菌活性,在防治小麦赤霉病上具有广阔的应用前景。为了揭示QoIs杀菌剂对小麦赤霉病菌DON毒素合成的调控作用,本文测定了吡唑醚菌酯、丁香菌酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、嘧菌酯和烯肟菌胺等6种QoIs杀菌剂对FgS-1、FaS-5和FaR-11等3株赤霉病菌DON毒素生物合成的调控作用。结果表明,6种QoIs杀菌剂EC50、10×EC50、100×EC50剂量处理均能显著促进赤霉病菌DON毒素的生物合成,与对照组相比增加了0.51-8.70倍,且能显著上调毒素合成相关基因TRI5的表达。另外,QoIs杀菌剂也能显著增加DON毒素生物合成前体物质-乙酰辅酶A的生物合成,这进一步证实了QoIs杀菌剂促进了赤霉病菌DON毒素的生物合成。为了进一步揭示QoIs杀菌剂的药理学机制,我们测定了QoIs杀菌剂EC50、10×EC50、100×EC50剂量处理对赤霉病菌细胞膜透性、呼吸速率、ATP含量、过氧化氢含量、丙酮酸含量等生理生化特性的影响。结果表明,QoIs杀菌剂EC50、10×EC50、100×EC50剂量处理可以增加赤霉病菌细胞膜的透性,降低病菌20.0%-46.0%的呼吸速率,减少细胞8.9%-73.7%的ATP含量、降低细胞7.8%-77.2%的过氧化氢含量。QoIs杀菌剂作用于线粒体呼吸链的细胞色素b（Cytb）的还原型辅酶Q的氧化位点（Qo位点）,抑制线粒体呼吸作用。但QoIs杀菌剂对线粒体形态的影响尚不明确。已有研究证实赤霉病菌产毒小体是在产毒条件下由内质网重组形成的细胞核外围的一种特殊球状结构,是DON毒素生物合成的场所。本文利用激光共聚焦显微镜技术研究了 QoIs杀菌剂对赤霉病菌产毒小体形成及线粒体形态的调控作用,同时利用透射电镜技术观察了 QoIs杀菌剂对赤霉病菌线粒体细胞结构的影响。结果表明,经QoIs杀菌剂EC50、10×EC50、100×EC50剂量处理,在共聚焦显微镜下可观察到产毒小体的数量增加,荧光信号强度增大。Western Blot结果显示,产毒小体形成相关蛋白TRI翻译水平显著增强;另外,QoIs杀菌剂能使线粒体出现明显的裂解破碎状。透射电镜拍摄的线粒体结构可以看出,杀菌剂处理后,线粒体内部出现空洞结构,呈现出溶解、畸形等状态。上述结果进一步证实了 QoIs杀菌剂能促进产毒小体的形成,且能使线粒体碎片化,破坏线粒体动态平衡。为了进一步测定QoIs杀菌剂对麦粒中DON毒素合成的影响,我们进行了麦粒接种模拟试验。结果显示,与不用药的对照组相比,QoIs杀菌剂处理后减少了60.0%-83.3%小麦粒中的菌丝侵染量,我们用两种方式对DON毒素水平进行了评价,即单位小麦粒重量下的毒素含量与单位菌丝侵染量的毒素含量。除啶氧菌酯外,其它QoIs杀菌剂EC50、10×EC50和100×EC50剂量处理后单位小麦粒重量下的毒素含量与单位菌丝侵染量的毒素含量均显著增加。啶氧菌酯处理后不能显著增加单位小麦粒重量下的毒素含量,但能显著增加单位菌丝侵染量的毒素含量。综上所述,QoIs杀菌剂虽然能显著降低麦粒中菌丝侵染量,但同时也会显著增加DON毒素的生物合成,加剧麦粒中毒素污染水平。综上所述,QoIs杀菌剂作用于呼吸链细胞色素bc1复合物,抑制赤霉病菌呼吸作用,降低三磷酸腺苷（ATP）产生,促进DON毒素生物合成前体物质-乙酰CoA的生物合成,同时影响内质网结构,使其发生重构,形成产毒小体,进而促进DON毒素生物合成。QoIs杀菌剂虽然对赤霉病菌有很好的抑菌效果,但能促进DON毒素生物合成的风险。因此,本文阐明了对赤霉病菌具有高活性的几种QoIs杀菌剂对DON毒素生物合成的影响及调控作用,为筛选抑制赤霉病菌DON毒素生物合成的化学或生物因子提供理论基础。该研究成果不仅对于QoIs杀菌剂的研发和安全性评价具有重要的理论意义,而且对于评价其他呼吸作用抑制剂的安全性及指导这些杀菌剂的农药登记和安全使用也具有重要的理论和应用价值。