2018年全球癌症统计报告显示,肺癌依然是新增发病率和死亡率首位的癌症。肺癌的治疗方案包括手术治疗、化疗、放疗以及免疫治疗等,都有相应的适应症,但对于术后复发和远端转移的肺癌患者化疗依然是重要的治疗手段之一,术后辅助化疗能延长病人的生存期。但是,化疗靶向性差,在杀死肿瘤细胞的同时也会损伤人体的正常细胞,特别是增殖较活跃的造血细胞,从而产生严重的毒副作用,影响患者的生存质量。因此,提高药物的选择性、降低药物的毒性以及对免疫系统的抑制作用、增加药物疗效等一直是肿瘤药物治疗极为关注的领域。放化疗后除了诱导肿瘤细胞凋亡,都不可避免产生衰老的肿瘤细胞,表现为:①细胞周期阻滞、细胞形态大而扁平、细胞核增大或形成多核等;②代谢旺盛,如溶酶体的β-半乳糖苷酶活性增加,定义为衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associated-β-galactosidase,SA-β-gal）,可作为细胞衰老检测的标志物;③DNA损伤的标志蛋白γ-H2AX、转录因子NF-κB等表达上调。另外,衰老最重要的特征是衰老相关的分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）,SASP含有上百种蛋白质,如细胞因子（如IL-1、IL-6、IL-8、MCP1）、生长因子（如VEGF）以及蛋白酶（如MMP）等。已有许多研究已证实,低剂量化疗药物可诱导肿瘤细胞衰老、抑制肿瘤生长,同时降低化疗药物副作用,但SASP的旁分泌作用能够影响肿瘤的微环境,促进邻近细胞的恶性转变和肿瘤的进展。因此肿瘤细胞的衰老具有两面性,如何能够在诱导细胞衰老发挥抗肿瘤活性的同时,最大限度地降低SASP的副作用,是细胞衰老及肿瘤治疗的研究热点。本课题组的前期数据显示,外源性的小分子药物（如多西他赛等）、内源性基因变化（如内质网分子伴侣蛋白AGR2、RCN1）等都可诱导肿瘤细胞衰老,但是衰老细胞的条件培养基对其它细胞增殖的影响却不相同,即:细胞的衰老表型相似,但衰老细胞产生的分泌表型不同。因此,本论文以肺癌为研究模型,以一线化疗药物多柔比星（doxorubicin,DOX）、天然双联苄类化合物地钱素C（marchantin C,Mar-C）和内质网蛋白 RCN1（reticulocalbin-1）为衰老的诱导因素,首先分析衰老的诱导机制不同是否影响SASP的组成和表达、产生不同的SASP表型;其次寻找能够降低或抑制SASP的小分子化合物,为抗肿瘤药物的发现和肿瘤衰老治疗提供新的思路。第一部分Mar-C和RCN1介导的细胞衰老及分泌表型分析一、Mar-C对细胞衰老及分泌表型的影响本课题组前期已对上千种天然产物进行抗肿瘤、抗炎活性的筛选,其中从苔藓植物中分离纯化的地钱素类双联苄化合物结构独特,不仅具有抗肿瘤活性而且毒性较低。Mar-C可以通过抑制微管促进肿瘤细胞的凋亡发挥抗肿瘤活性,但抑瘤浓度较高（IC50约为10 μM）,此外其可显著抑制内皮细胞以及肿瘤细胞内IL-6的表达（未发表数据）,具有抗炎活性。因此,我们选择Mar-C作为潜力化合物,分析其在较低浓度是否能够诱导肿瘤细胞的衰老,是否通过其抗炎活性影响衰老细胞的SASP。由于DOX已被证实可诱导肿瘤细胞衰老,以DOX为阳性对照,进行小分子化合物对细胞衰老及SASP影响的探讨。1.低剂量Mar-C促进肿瘤细胞衰老（1）低剂量Mar-C（2 μM）抑制肺癌细胞增殖,但对正常细胞无影响。细胞增殖实验结果表明,2 μM Mar-C可选择性地抑制肺癌细胞（A549和H1299）的增殖、抑制细胞克隆的形成。MTT、EdU掺入实验结果显示,Mar-C不影响正常人皮肤成纤维细胞（NHF）、人支气管上皮细胞（HBE）和人胚肺成纤维细胞（IMR90）的生长。（2）Mar-C促进肿瘤细胞衰老。A549细胞和H299细胞在2μM Mar-C刺激5d后均表现出细胞衰老的典型特征:细胞体积增大、细胞扁平以及SA-β-gal呈显著阳性着色。同样,2μMMar-C也对正常NHF细胞无诱导衰老作用。而在细胞凋亡标志物——多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribosepolymerase,PARP）的检测中,2 μM Mar-C作用A549细胞1 d和5 d后,PARP的剪切并无增加,表明2 μM Mar-C主要促进肺癌细胞衰老而不是凋亡。同时,我们发现0.3 μM DOX显著诱导肿瘤细胞和正常细胞衰老。2.低剂量Mar-C诱导衰老细胞产生的SASP对其他细胞增殖的影响较小为了确定Mar-C和DOX对衰老细胞SASP的影响,我们利用Mar-C和DOX诱导细胞衰老后的条件培养基,分析其对细胞增殖的影响。Mar-C诱导的条件培养基可以促进A549细胞的增殖,但其作用要显著弱于DOX诱导的条件培养基;更为重要的是,Mar-C诱导的条件培养基对HBE细胞无显著影响,而DOX诱导的条件培养基则显著促进HBE细胞的增殖。因此,Mar-C诱导的SASP其促细胞增殖作用显著弱于DOX,而且对正常细胞无显著影响。二、RCN1调控的细胞衰老及分泌表型分析RCN1是内质网钙离子结合蛋白CREC家族的成员,在正常组织广泛表达,其生理功能尚不清楚。目前发现,RCN1在多种肿瘤中高表达,可能与肿瘤的耐药、侵袭转移相关,但作用及机制研究报道较少。本课题组前期研究发现,下调RCN1的表达能够引起前列腺癌细胞衰老和细胞的凋亡（凋亡率约40%）,本论文对其调控的衰老进行分析。1.下调RCN1诱导肿瘤细胞和正常细胞衰老下调RCN1表达,九株不同类型的肿瘤细胞均呈现显著的衰老样表型和SA-β-gal阳性染色,而且下调RCN1表达同样促进正常成纤维细胞NHF衰老。同时,细胞克隆形成实验结果显示,下调RCN1表达,肿瘤细胞和正常细胞的增殖能力均显著下降。2.下调RCN1显著诱导SASP表型利用下调RCN1后衰老细胞的条件培养基进行初步的分泌表型分析结果发现,衰老细胞的条件培养基可以促进肿瘤细胞A549和正常细胞HBE的增殖。进一步研究发现,Mar-C诱导A549细胞衰老不会引起RCN1的表达下调,推测Mar-C诱导的A549细胞衰老与RCN1无关。综上,Mar-C、DOX和下调RCN1均可诱导肿瘤细胞衰老,对衰老细胞分泌表型的影响却各不相同。2 μMMar-C有良好的细胞选择性,而DOX和RCN1对正常细胞也有影响,表明它们在诱导细胞衰老以及调控相关衰老表型（如SASP等）的机制不同。因此,后续实验中我们将以2 μM作为Mar-C体外实验剂量,对其调控细胞衰老及分泌表型的机制进行研究。第二部分Mar-C调控细胞衰老及分泌表型的机制研究进一步对Mar-C诱导肺癌细胞衰老以及SASP表达调控的机制进行研究,同时在整体动物水平对低剂量Mar-C抗肿瘤活性进行评价。一、Mar-C在转录水平调控SASP1.Mar-C可诱导SASP表达,弱于DOX诱导的SASP表达通过抗体芯片定量分析Mar-C和DOX诱导衰老细胞SASP的分泌变化,结果显示,与对照组相比Mar-C处理后炎症因子IL-1α、IL-6和IFN-γ的分泌增加,但IL-8、MCP-1和IL-10均无显著变化,TNF-α和IL-13的分泌显著下降。DOX增加促炎因子IL-1α、IL-6、IFN-γ和IL-8的表达,对MCP-1的影响不显著,下调抑炎因子IL-13、IL-10的作用较为显著。因此,DOX和Mar-C诱导细胞衰老后均可产生SASP,但影响程度不同,DOX对促炎因子的增加和抑炎因子的抑制程度高于Mar-C。采用Q-PCR分析DOX和Mar-C在转录水平调节SASP中相关因子的表达。结果显示,Mar-C和DOX能够在转录水平调控SASP主要组分的表达,其调控趋势与SASP分泌蛋白相一致,但与DOX相比,Mar-C对于SASP相关因子的mRNA表达的影响较弱。2.Mar-C通过激活NF-κB调节SASP的表达Mar-C和DOX在转录水平调控SASP的表达,因此转录因子可能参与其调控过程。Q-PCR 结果显示,Mar-C 对 STAT1、STAT3、GATA4 和 C/EBPβ 的 mRNA表达并无显著影响,Western blotting结果显示Mar-C对于TFE3、TFEB、STAT1和STAT3四种转录因子的表达和活化没有影响。NF-κB是最重要的炎症调控因子,我们发现Mar-C能显著增加NF-κB的亚基p65的磷酸化水平,并促进其入核。进一步分析发现,Mar-C能够通过上调IKKα/β的磷酸化激活IκBα,进而激活NF-κB入核。下调p65的表达能显著抑制IL-6、IL-8、TNF-α、IL-5和IL-10的表达,并部分逆转Mar-C对IL-1α、IL-1β和IL-4的调节作用。因此,NF-κB部分参与Mar-C对SASP调控。二、Mar-C通过DNA损伤机制诱导细胞衰老Mar-C和DOX均能诱导肿瘤细胞衰老,但对SASP调控作用有差异。低剂量Mar-C对促炎性的SASP影响较小,因此Mar-C具有良好的抗肺癌药物开发潜力。由于DOX诱导肿瘤细胞衰老的机制已有很多报道,因此我们重点对Mar-C诱导肺癌细胞衰老的机制进行深入探讨。1.Mar-C阻滞细胞于G0/G1期细胞周期阻滞是细胞衰老的重要特征,我们检测了 2 μMMar-C处理后A549细胞的周期阻滞情况。结果显示,Mar-C能够通过抑制周期蛋白CyclinD1的表达,将细胞阻滞在G0/G1期。2.Mar-C诱导细胞衰老部分依赖p21的表达p53-p21和p16-Rb是细胞周期阻滞和衰老的关键信号通路。Western blotting结果表明,Mar-C上调A549细胞中p53和p21的表达,下调Rb和p-Rb的表达。进一步分析发现,下调p53的表达或通过抑制剂阻断p53的活性,并不能显著逆转Mar-C诱导的细胞衰老,此外Mar-C也显著诱导p53突变细胞株（H1299和H446）发生衰老,因此Mar-C诱导肺癌细胞衰老是p53非依赖。而敲低p21的表达,则可以部分逆转Mar-C导致的A549细胞增殖受阻,表明Mar-C诱导A549细胞衰老部分依赖其对A549细胞中引起的p21上调。3.Mar-C通过DNA损伤机制诱导细胞衰老（1）Mar-C诱导DNA损伤、抑制DNA修复蛋白的表达。由于DNA损伤机制通常是药物诱导细胞衰老的主要机制,我们首先分析Mar-C对DNA损伤的影响。Western blotting、免疫荧光和彗星电泳结果显示,Mar-C时间依赖性促进A549细胞中γ-H2AX升高,核内有清晰的γ-H2AX焦点聚集,出现显著的慧星拖尾现象,表明Mar-C显著诱导DNA损伤。另外,Mar-C能够下调A549细胞修复蛋白BRCA1磷酸化水平和RAD51的表达,并且抑制多种DNA损伤修复相关基因的mRNA表达。（2）Mar-C通过ROS引起DNA损伤。基于Mar-C诱导的快速DNA损伤（30min）及其化学结构中的酚羟基,推测ROS是导致细胞发生快速DNA损伤的原因。结果显示,Mar-C显著增加A549细胞中ROS水平,与DNA损伤发生时间一致。抗氧化剂N-acetyl-L-cysteine（NAC）可显著逆转Mar-C诱导DNA损伤的作用,表明Mar-C能够通过上调细胞ROS水平引起细胞DNA损伤。三、Mar-C可显著抑制肿瘤的生长、延长荷瘤小鼠的生存期根据Mar-C诱导细胞衰老的作用,我们进一步分析Mar-C在体内是否可以通过诱导肺癌细胞衰老而发挥抗肿瘤活性。采用两种动物模型进行分析,即A549-luc细胞构建的异种移植模型和LLC细胞构建的同种移植模型。1.Mar-C诱导肿瘤细胞衰老,抑制肿瘤生长活体动物成像实验结果显示,Mar-C给药处理后,裸鼠瘤组织的荧光强度显著降低,平均瘤体积显著减小,表明Mar-C可以抑制肿瘤的生长。冰冻切片衰老染色和Ki-67免疫组化染色显示,Mar-C能够显著促进肿瘤组织中的细胞衰老,抑制肿瘤细胞增殖。2.Mar-C无显著毒副作用,显著延长荷瘤小鼠的生存期通过分析给药期间各组裸鼠的体重变化以及肝功能评价,发现DOX组裸鼠体重呈现了持续下降的趋势,而Mar-C组与对照组裸鼠的体重并无差异。另外,DOX具有明显的肝脏毒性,而Mar-C对裸鼠肝功能指标并无影响,显示Mar-C对小鼠的肝毒性较低。小鼠生存分析发现,与DOX相比Mar-C能显著延长荷瘤小鼠的生存期。3.Mar-C联用免疫调节剂硫酸化可德兰多糖具有协同增效作用由于Mar-C对炎性SASP并无显著影响,可能不显著抑制免疫应答。我们采用联合用药的方法,分析免疫调节剂硫酸化可德兰多糖（Curdlansulfate,CS）是否能促进Mar-C的抗肿瘤作用。构建鼠源肺癌细胞株LLC同种移植荷瘤模型,进行联合用药的药效评估。结果显示,DOX、Mar-C及Mar-C与CS联用均对肿瘤生长有显著的抑制效果,其中Mar-C与CS联用组表现出一定的协同增效作用。Ki-67免疫组化染色结果显示,Mar-C组以及联用组的Ki-67着色程度较弱,显示了良好的抑制肿瘤细胞增殖的活性。同时,DOX组小鼠运动能力减弱,体重显著下降,而Mar-C组小鼠体重并无变化,联用CS组的小鼠体重呈现增加的趋势,提示我们Mar-C联用CS后,发挥一定的增效减毒作用。脾指数的统计结果显示,DOX对于脾脏的损伤较严重,具有潜在的免疫抑制作用,而Mar-C以及联用CS组脾指数增加,无免疫抑制作用。与对照组相比,Mar-C组小鼠肝功能指标没有显著性差异。综合上述结果,Mar-C通过诱导肿瘤细胞衰老、抑制其增殖,具有抗肿瘤活性,而且无显著的毒副作用。第三部分RCN1调控衰老及分泌表型的机制研究前期数据表明,下调RCN1的表达能够引起多种肿瘤细胞和正常细胞的衰老,没有细胞选择性,且衰老细胞的条件培养基显著促进其它细胞的增殖,我们对RCN1诱导细胞衰老及SASP的调控作用机制进行探索。一、下调RCN1在转录水平显著促进SASP的表达1.下调RCN1促进SASP炎症因子的分泌蛋白芯片检测结果显示,下调RCN1使IL-1α、IL-6和TNF-α增加显著,IL-8、IFN-γ也有所增加,而MCP-1、IL-10和IL-13呈下降趋势。下调RCN1诱导肿瘤细胞衰老的SASP中,IL-6和IL-1α的变化最为显著,抑炎因子的相对含量虽然较低,但依然呈下降的趋势。因此,RCN1表达下调,能够在翻译水平影响SASP的表达。2.下调RCN1促进炎性SASP因子的转录为了确定下调RCN1引起SASP分泌的改变是否因mRNA表达变化引起,使用Q-PCR分析下调RCN1的表达后SASP相关因子mRNA的变化。结果显示,下调 RCN1 表达后,炎症因子 IL-6、IL-8、IL-1α、TNF-α、ICAM 和 COX2的表达显著增加,IL-1β呈下降趋势,证实下调RCN1后促进炎性SASP因子的mRNA转录。3.NF-κB和STAT1可能参与RCN1对SASP的转录调控mRNA表达受转录因子的调控,Western blotting结果显示,下调RCN1表达抑制转录因子STAT3的表达以及入核,但是能够促进转录因子NF-κB亚基p65和STAT1的磷酸化水平显著上调、入核增加,我们推测NF-κB和STAT1可能参与RCN1对SASP的调控。二、下调RCN1导致DNA损伤、诱导细胞衰老1.下调RCN1诱导细胞衰老、细胞周期S期阻滞基于SASP的调控不同于Mar-C诱导的肺癌细胞衰老,我们对RCN1下调诱导衰老的机制进行深入研究。Western blotting结果显示,下调RCN1表达显著上调A549细胞中p53和p21的表达,降低Rb磷酸化水平,而下调RCN1又可以诱导p53突变型的细胞株（H1299、U251和PC3）衰老,因此推测,RCN1下调导致的细胞衰老为p53非依赖,p21-Rb途径在下调RCN1诱导衰老的过程中起重要作用。进一步研究发现,下调RCN1显著抑制A549细胞中周期蛋白Cyclin A的表达,同时对6株肿瘤细胞的周期检测结果显示,RCN1下调后的细胞周期阻滞发生在S期。2.下调RCN1导致DNA损伤、DNA修复受抑制S期是DNA合成、复制的时期,因此我们研究了 RCN1下调对DNA损伤的影响。结果显示,下调RCN1后A549细胞DNA合成受阻,DNA损伤标志性蛋白γ-H2AX显著升高,在细胞核中有清晰的γ-H2AX斑点状聚集。在RCN1对损伤修复相关因子转录和翻译的影响中发现,下调RCN1对DNA修复相关因子的mRNA表达调控不同于其在蛋白水平的调控（BRCA1的磷酸化和RAD51表达被抑制）。3.RCN1定位和功能不局限于内质网RCN1为内质网蛋白,但其却能够影响细胞核内的DNA损伤修复,因此我们对RCN1的分布进行了探索,发现DNA损伤药物和电离辐射均能够引起RCN1在细胞核内的点状聚集,非DNA损伤药物没有此效应。且DNA损伤药物产生的γ-H2AX斑点与RCN1斑点具有共定位,而在电离辐射引起的DNA损伤中没有发现。推测可能与它们引起的DNA损伤特点不同有关。三、下调RCN1影响可变剪切,调控DNA损伤和SASP相关通路基于RCN1与DNA复制、损伤修复的关联,采用免疫共沉淀法收集RCN1相互作用蛋白,进行质谱鉴定分析。GO分析结果显示,RCN1相互作用蛋白与可变剪切有关。可变剪切功能实验显示,下调RCN1表达抑制选择性跳跃剪切这一类型,上调RCN1表达能够增加可变剪切荧光素酶报告质粒的荧光强度。转录组测序分析结果显示,下调RCN1表达,可变剪切的5种类型与对照组相比均有显著性差异。GO分析发现显著性差异的可变剪切事件与DNA损伤、复制和修复通路以及炎症应答、NF-κB通路有关。四、下调RCN1增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性1.RCN1的生物信息学分析生物信息学分析结果显示,RCN1在组织器官中普遍表达,在肿瘤细胞中表达普遍高于正常组织,并且与患者生存期负相关。Western blotting检测显示,5株正常细胞和9株肿瘤细胞中RCN1表达程度不同。2.下调RCN1表达增加肿瘤细胞的药物敏感性药物敏感性实验的MTT结果显示,下调A549细胞中RCN1的表达细胞对DNA损伤类化疗药物和靶向化疗药物的敏感性显著增加;过表达A549细胞中的RCN1,细胞对部分化疗药物（VP16、DOX、GEM和MG132）的耐受增加,提示RCN1可能与肿瘤的耐药性有关。本章节我们探讨了 RCN1下调对衰老细胞SASP的调控,研究中发现,RCN1的表达影响DNA损伤修复以及肿瘤细胞的化疗药物反应,提出RCN1通过可变剪切调控DNA损伤和细胞衰老的机制,这一发现可以为肿瘤治疗提供新的研究思路。创新点:（1）发现新型的诱导肿瘤细胞衰老的化合物Mar-C,不显著增加SASP,具有良好的细胞选择性,毒性低,具有研究潜力;（2）首次发现内质网蛋白RCN1下调可诱导多种细胞衰老,并且RCN1可定位细胞核,通过可变剪切机制调控DNA损伤和SASP;（3）DNA损伤介导多种因素诱导的衰老,虽然衰老的表型相似,但衰老细胞产生的SASP却大不相同,在SASP的组成成分和表达水平上均存在显著差异。不足之处:（1）Mar-C对SASP其他转录因子的调控没有阐明,需要进一步的研究;（2）RCN1对SASP的调控机制研究不够细致和深入;（3）RCN1与可变剪切蛋白的相互作用没有进行细胞内的验证。