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大豆中所富含的大豆异黄酮能够预防及改善多种疾病已被多方认可,近年来大量研究表明大豆异黄酮中许多生物活性是有雌马酚来实现的,但是雌马酚的来源却异常匮乏,目前即便在国际上雌马酚也只能通过化学方法进行合成,由于合成涉及的中间步骤较多,大量的副产物既降低了转化效率又增加了雌马酚分离纯化的难度,加上使用的化学催化剂价格昂贵,致使试验所用的雌马酚标准品的国际市场销售价格昂贵,Sigma公司3990元/5mg,国内公司2000/5mg,这也许是人体干预实验较少的原因之一。本项目以素食者和非素食者的尿样为样品,检测高产雌马酚供试者并采集其粪样,采用菌种培养分离纯化技术和紫外法,以雌马酚产出量为评价指标,比较观察产雌马酚菌,培养分离雌马酚高产菌株。主要深入了解素食者产雌马酚能力及产出相关细菌的种类和分离培养条件,再通过单因素和正交试验考察培养条件对雌马酚生成能力的影响。用生理生化实验以及16S rRNA序列分析技术对分离出来的单一菌株进行菌种鉴定,以及提高雌马酚转化成能力的最适培养条件。通过深入研究素食者雌马酚产出相关细菌的种类和分离培养条件,为体外雌马酚高生物转化的实现奠定了一丝基础,为新菌株、新的细菌区系和新技术平台的建成尽上绵薄之力。本文研究成果不仅具有理论意义,对提升大豆及大豆制品的经济附加值,开拓雌马酚来源途径也具有实际应用价值和意义。以合肥兰旭生物技术有限公司雌马酚标准品为样品,通过紫外分光光度计对标准品进行定性定量分析,测得最大吸收波长为204nm。以素食者和非素食者的的尿样为样品,通过单因素和正交实验对尿样的脱色条件和纯化工艺进行研究,以雌马酚产量为评价指标,在脱色时间40-60min、脱色温度70℃、活性炭用量3g的脱色条件下,解吸剂浓度80%,解吸剂用量55mL,上样量8mL,吸附时间5h纯化工艺条件下测得50ml尿样中雌马酚含量平均含量为28.6020μg/mL,并且对素食者和非素食者的三种生活状态下的晨尿进行检测,结果雌马酚含量食用大豆异黄酮保健品>正常生活>禁食大豆制品,并且素食者平均产雌马酚含量高于非素食者3-5倍,在食用大豆异黄酮后素食者产雌马酚为10.64μg/mL,非素食者为3.49μg/mL。以高产雌马酚素食者做为粪样供试者,以菌落清晰度和雌马酚产量为指标通过单因素实验最优稀释度为104最适合进行后续实验,分别从麦康凯、MRS、IRIE、BHI青春双歧杆菌五种培养基,经过滚管法、厌氧管法、平板法等三种培养方式,分别进行培养并筛选,最终得出结论在厌氧条件下用104稀释液以平板划线的方式接种于麦康凯和BHI培养基上,培养产雌马酚肠道菌效果最佳。以雌马酚产量为指标,通过单因素和正交实验研究麦康凯和BHI培养基中产雌马酚菌的最佳培养条件,在麦康凯培养基中培养36h,pH7.0,底物浓度为4.25mg/mL的条件下连续培养n次,获得单一的菌落,并命名为LJ-G1,经过革兰氏染色及电镜扫描可知LJ-G1为革兰氏阴性杆菌,菌体呈棒状有鞭毛；BHI培养基以葡萄糖为碳源,在37℃,PH7.0厌氧环境下培养26h连续培养n次,获得较为单一的菌落,并命名为LJ-Q2,经过革兰氏染色及电镜扫描可知,LJ-Q2为革兰氏阳性球菌,菌体呈球状,菌体圆润无鞭毛。再经过生理生化实验和16SrDNA全序列测定结果,查阅《常见细菌系统鉴定手册》得出LJ-G1菌株属于河生肠杆菌(Enterobacter.amnigenus);LJ-Q2菌株与氨基酸球菌(Acidaminococcus Rogosa)与其十分相近。综上所述,在完成项目研究内容,达到预期目标过程中实现了以下成果创新。从素食者肠道菌中成功分离培养出高产雌马酚菌,将成为首次。对高产雌马酚菌进行鉴定,发现新菌种为菌株应用提供基础数据。本文研究成果不仅具有理论意义,对提升大豆及大豆制品的经济附加值,开拓雌马酚来源途径也具有实际应用价值和意义。