甘露醇是一种六碳糖醇,在食品、医药和化工等多个领域都具有非常广泛的应用。目前甘露醇的生产方法主要有植物提取法、催化加氢法、酶转化法和微生物发酵法,其中微生物发酵法具有条件温和、不产山梨醇、产品质量高并且转化率高等优点,已经发展为主要趋势。已知的自然界中有许多种类的微生物可以生产甘露醇,明串珠菌是美国FDA认可的GRAS菌,进行异型乳酸发酵,可以在胞内产生甘露醇脱氢酶,在发酵生产甘露醇的研究方面具有明显的优势。菊粉价格低廉,是一种存在于大量植物中的天然果聚糖,能够被菊粉酶水解为低聚果糖和果糖,可以成为一种低成本的果糖资源。因此,在明串珠菌中实现从菊粉到甘露醇的转化,对甘露醇的生产研究具有重要意义。本研究将来自黑曲霉的菊粉酶基因进行了密码子优化,并将其与明串珠菌CGMCC1.10327本身的表达元件相连,构建了内切菊粉酶InuA基因表达盒和外切菊粉酶InuE基因表达盒。以乳酸脱氢酶D-ldh、0503-ldh、0373-ldh基因和乙醇脱氢酶adh基因作为基因敲入位点,通过两次同源重组将InuA表达盒和InuE表达盒整合到明串珠菌的染色体上进行外源表达,构建了多个基因敲入菌株。其中,为了研究内切、外切菊粉酶基因的协同作用,构建了二者同时敲入的突变菌株,为了达到更好的表达效果,将InuE基因进行了多个拷贝并得到了最佳拷贝数。通过改变发酵底物的种类、浓度和发酵时间来研究突变菌株最适宜的发酵条件。结果表明,InuA基因和InuE基因在明串珠菌CGMCC1.10327中均成功表达,但InuA基因表达产生的内切菊粉酶在明串珠菌中的活性并不高,对于明串珠菌利用菊粉的能力没有起到太大作用,多基因敲除并且InuE基因的三个拷贝累加敲入对甘露醇产量有着较大的提高,突变菌株ΔWΔadh::InuEΔ0503::InuEΔ0373::InuE在50 g/L蔗糖和20 g/L菊粉作为底物发酵28 h时,甘露醇产量最高,为42.93 g/L,与原始菌株相比,产量提高了36.4%。