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慢性粒细胞白血病一旦发展至急变期,预后极差,目前的各种治疗方法均不能有效控制其病情进展,多在数月内死亡,因而加强对急变期的研究具有很重要的科学及临床意义。急变发生机制中,BCR-ABL融合基因大量表达、继发性多种基因突变以及凋亡受阻、耐药等机制逐渐已经被阐明,但有关分化障碍的机制研究很少且不明确[1;2]。分化障碍往往与信号通路中的转录因子异常有关,FoxO3a是FOX转录因子家族是一个重要成员,是BCR-ABL/PI3K/AKT信号通路的下游因子,而其在慢粒急变中的功能失活,可能在慢性粒细胞白血病的发生发展中发挥重要作用,值得进一步研究。
目的:研究FoxO3a去磷酸化激活或过表达后,对慢粒急变细胞K562细胞株的增殖、凋亡及诱导分化作用,明确FoxO3a是否具有诱导慢粒急变细胞分化作用,并研究FoxO3a与造血分化调控因子Tall、BTG1基因的关系,初步探讨FoxO3a对慢粒分化障碍的机制,有利于从分化障碍角度进一步明确慢粒急变的机理,并为慢粒急变提供一个新的诱导分化治疗方法和靶点。
方法:采用基因重组技术从人单核细胞中提取。RNA反转录成cDNA,以其为模板,使用含有酶切位点的引物进行PCR扩增,回收PCR产物,对pIERS2-EGFP和PCR回收产物进行酶切、纯化、连接,并转化和筛选抗性细菌克隆,提取质粒,进行酶切、测序鉴定,获得pIERS2-EGFP-FoxO3a质粒。通过非脂质体Fu GenE HD转染试剂将pIERS2-EGFP-FoxO3a质粒转染K562细胞。以PCR、Western-blot检测FoxO3a基因的表达效果。增强FoxO3a在K562细胞中的表达后,通过CellTiter-Blue Cell viabilityAssay检测K562细胞的活性变化;流式细胞术检测细胞周期时相分布、细胞凋亡;Western-blot检测p27kip1、Bim基因的表达变化;采用联苯胺染色检测K562细胞联苯胺阳性率、流式细胞术细胞检测表面抗原GPA、CD11b的表达变化;通过PCR、Western-blot检测分化相关基因Tall、BTG1的表达情况。
结果:成功构建重组质粒pIERS2-EGFP-FoxO3a,经过酶切和测序鉴定与预期目的一致。非脂质体Fu GenE HD转染试剂介导K562细胞转染质粒pIERS2-EGFP-FoxO3a,应用PCR、Western-blot鉴定证实目的蛋白FoxO3a,在K562表达。转染重组质粒pIERS2-EGFP-FoxO3a组与其它对照组相比,Cell-titerblue结果显示细胞增殖能力减弱(p<0.05);流式细胞术显示细胞阻滞在G0/G1期,并伴随着p27kip1表达升,细胞调亡比例增加且伴随着Bim的表达升高,提示FoxO3a可上调Bim基因的表达促进细胞的凋亡。增加K562细胞中FoxO3a基因的表达后,联苯胺染色阳性率升高,细胞形态学趋向于成熟方向分化改变,细胞表面GPA抗原表达升高,髓系细胞表面分化抗原CD11b较对照组及空白对照组升高,但不如GPA抗原变化明显,同时伴随着Tall、BTG1基因的表达降低。FoxO3a可诱导K562细胞向成熟细胞分化,其机制可能与下调Tall、BTG1的表达有关。
结论:成功构建重组质粒pIERS2-EGFP-FoxO3a;过表达FoxO3a可抑制细胞增殖;可上调p27kip1、Bim基因的表达,阻滞细胞周期进程和促进细胞凋亡。FoxO3a可诱导K562细胞向红系分化,其机制可能与下调造血分化因子Tall、BTG1的表达有关。