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丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)隶属于黄病毒科(Flavivirdae)肝炎病毒属(Hepacivirus),为单股正链RNA病毒。HCV编码的非结构蛋白NS5B是一个依赖RNA的RNA聚合酶,在病毒基因组复制中发挥核心作用。NS5B由手掌、手指和拇指三个结构域组成,其中拇指结构域包含一个向活性中心延伸的β-发卡(氨基酸残基443-454),被认为在NS5B以从头(de novo)合成模式引发RNA复制过程中起到关键作用,然而其具体作用机制尚不清楚。一项未能得到充分关注的前期研究表明,当截去该发卡中的8个残基后,对应的NS5B突变体既可从模板RNA的末端引发也可从模板内部引发,而野生型NS5B只能实现末端引发,暗示该β-发卡在NS5B从模板末端精确引发从头合成过程中起到至关重要的作用。 为深入剖析该β-发卡在HCV NS5B催化RNA合成中的确切功能,本研究针对上述β-发卡区域设计和构建了NS5B的系列截短突变体和点突变体,在体外以末端引发和内部引发两种从头合成模式对NS5B的聚合酶催化性质进行了表征,并以聚合酶在两种模式下合成目标产物的比值来评测聚合酶对末端引发的倾向性。结果表明,野生型NS5B具有明确的末端引发的倾向。而突变体中,除Y448M和D1-Y448与野生型较为类似,其余突变体的末端引发倾向性均较低。这些与野生型NS5B存在显著差异的突变体中,既有多残基截短突变体,也有单残基截短和单位点替换的突变体,表明由突变造成的对β-发卡构象的较小扰动即可能显著降低NS5B聚合酶合成的末端引发倾向,提示了β-发卡对末端引发的精准控制。本研究还对野生型NS5B及其突变体依赖引物模式的合成进行了表征,结果显示除了多残基截短突变体表现出比野生型更高的活性,其他突变体活性均与野生型相似。这一结果提示依赖引物模式的合成很可能需要β-发卡构象发生较大变化,从而腾出空间给模板-引物双链进入活性中心。对β-发卡的较小扰动不足以导致这一构象变化,因此相应的突变体和野生型类似,在该模式的催化反应中表现出较低的活性。以上结果说明野生型HCV NS5B倾向于从模板末端引发从头合成而不利于依赖引物的合成模式,而β-发卡区域对NS5B实现从末端精确引发至关重要。 在研究β-发卡在聚合酶合成引发阶段的作用机制的同时,本研究还针对β-发卡在聚合酶合成的延伸阶段是否发挥作用这一问题进行了初步探索。延伸复合物稳定性测试表明野生型NS5B形成的复合物稳定性高于其突变体,暗示β-发卡在聚合酶合成的延伸阶段亦可能发挥重要作用。 本研究系统地分析了β-发卡在HCV聚合酶NS5B引发RNA从头合成过程中的作用机制,为进一步研究NS5B的功能提供了重要基础,同时也为其他从头合成型的RNA病毒聚合酶的功能研究提供了参考依据。