奶牛乳腺炎是奶牛最常见的多发性疾病之一,给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。目前,大多使用抗菌药物对奶牛乳腺炎进行防治,但是由于抗菌药物的长期使用乃至滥用,导致了奶牛乳腺炎致病菌的耐药性不断增强,成为奶牛养殖业面临的重要难题。导致奶牛乳腺炎的主要病原菌是金黄色葡萄球菌,大肠杆菌和链球菌。近年来,对金黄色葡萄球菌和链球菌导致奶牛乳腺炎的致病机制的报道较多,关于奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株致病机制和耐药机制的研究则相对较少。群体感应系统是细菌为适应某些特殊环境利用自身产生的化学分子作为信号通讯去改变其生理行为的过程。群体感应信号分子AI-2被认为是广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的种间通讯信号。在大肠杆菌模式株中,AI-2的调控机制研究较多。但是,在临床致病性大肠杆菌中,AI-2对大肠杆菌耐药基因及其相关基因的表达调控机制的研究国内外鲜有报道。本研究旨在通过对群体感应信号分子AI-2对奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株耐药性的调控机制的研究,从而为控制奶牛乳腺炎疾病的产生提供实验依据。1.为了检测奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株的耐药性,本研究利用二倍稀释法和梯度稀释法检测了奶牛乳腺炎E.coli DCM1临床分离株对多种抗菌药物的耐药性,结果发现,该菌株对氨苄青霉素、苯唑西林、青霉素G和氯霉素的最小抑菌浓度分别为4.5 mg/mL、6.5 mg/mL、3.5 mg/mL和2.0μg/mL,表明该菌株为典型的青霉素类多重耐药大肠杆菌。2.利用PCR扩增技术和特异性酶切图谱检测大肠杆菌的耐药基因以及耐药基因与转座子质粒的位置关联。结果表明,质粒介导的耐药基因tem编码超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),以及超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性大肠杆菌是导致奶牛乳腺炎的主要原因。3.本研究利用菌落计数法和比浊法通过添加外源的AI-2检测其对大肠杆菌生长的影响,结果表明,外源添加AI-2可使E.coli DCM1的耐药性增强。4.本研究利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测耐药基因tem的转录水平。结果显示,氨苄青霉素、苯唑西林和青霉素G的压力下,添加外源的AI-2会导致tem基因的转录水平分别提高2.1倍,2.4倍和2.4倍。5.通过过表达AI-2胞内受体LsrR蛋白并将其纯化后利用凝胶阻滞实验,使不同量的LsrR蛋白与tem启动子区域特异性结合,结果表明,外源添加AI-2通过LsrR蛋白间接地上调tem的转录水平。因此,本研究结果证明了外源添加AI-2通过上调tem的表达增强奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株的耐药性。综上所述,本研究利用PCR扩增技术和RT-qPCR技术以及凝胶阻滞电泳实验证明了群体感应信号分子AI-2能够上调奶牛乳腺炎大肠杆菌tem基因的转录水平,该调控与AI-2在胞内的受体蛋白LsrR直接相关。因此,本研究为进一步研究大肠杆菌多重耐药机制提供了有效的实验方法。