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合成生物学是基于系统生物学的遗传工程,其主要内容之一是通过人为地设计和操纵生物体的生物代谢途径,从而合成预先设计的高附加值天然化合物[1,2],这一研究方向也称为天然产物合成生物学[3]。天然产物合成生物学常用微生物作为底盘细胞,包括大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒状杆菌和假单胞菌,它们的可适性强,能够适应各种工程菌代谢途径优化的改造工具和手段。此外,微生物具有繁殖速度快和蛋白质多产等特点,因此将微生物变成细胞工厂,通过优化发酵工艺和放大发酵体积以实现天然产物的大规模生产是药用资源可持续发展的有效防范之一[4–6]。本论文运用合成生物学的方法,探索中药活性成分的替代资源,包含两部分内容,一是熊胆粉替代资源的规模化发酵工艺优化,二是丹酚酸在酿酒酵母中的生物合成途径优化。一、熊胆粉替代资源的规模化发酵工艺优化目的:以发酵罐作为反应器,简化并放大发酵规模,提高底物添加量,降低生产成本的同时完善制备工艺,并对发酵产物进行制备、成分分析和质量监控,提高研究的实用价值。方法:1.根据不同条件下重组大肠杆菌BL-α1β2菌株的生长曲线,优化种子预培养条件;2.利用响应面8.0.6.1软件的Box-Behnken设计（BBD）法,以光密度(OD600)和转化率为双重指标,在M9培养基无机盐成分的基础上优化培养基的碳源和氮源;3.通过摇瓶发酵培养,确定诱导剂的最适添加浓度,进一步将诱导剂添加时间点和诱导时长进行正交组合实验优化诱导过程;4.优化发酵时长、发酵温度、静置时长和静置温度等多个发酵工艺参数,确定最终的发酵工艺;5.建立用D101大孔树脂纯化发酵液的方法;6.采用优化的生产工艺,分别制备以粗制鸡胆粉和精制鸡胆粉为底物获得的发酵产物,并进行胆汁酸、氨基酸的成分分析,水份和内毒素的含量测定。结果:1.一级种子用LB培养基培养12小时,二级种子用2-YT培养基培养5小时,37℃,225 rpm,实验中所有接种量均为5%;2.以甘油和酵母提取物为碳、氮源更有利于工程菌生长和产物TUDCA的形成,最佳浓度分别为28.43 m L/L和20 g/L。在补料配方和补料流加方式优化实验中发现,工程菌在生长后期也即平台期的OD600值基本不受补料配方和流加方式的影响,但磷酸盐对TCDCA的转化率有显著促进作用。结合摇瓶培养时PBS-M9培养基有利于TCDCA向TUDCA转化的结果,确定了优化培养基为6.78 g/L Na2HPO4,3 g/L KH2PO4,0.5 g/L Na Cl,1g/L NH4Cl,2 m M Mg SO4,0.1 m M Ca Cl2,28.43 m L/L甘油、20 g/L酵母提取物及3 g/L（NH4）2HPO4,称之为M9-GY培养基,用于后续的工艺优化过程;3.诱导剂的最适添加浓度为0.3 m M,在对数前期加入诱导剂转化率最佳,添加的时间越晚转化效率越低,对数后期加入诱导剂TCDCA几乎无转化,对数前期添加诱导剂诱导3 h为最佳诱导组合条件;4.最终发酵工艺以富含TCDCA的粗制或精制鸡胆粉为底物,3 L的发酵体积,将部分TCDCA生物转化为TUDCA,并最终达到TUDCA与TCDCA的比例约为1.2±0.2。诱导后的发酵过程为:加入底物鸡胆粉（30 g精制鸡胆粉或35 g粗制鸡胆粉）,同时将发酵温度设为25℃,p H值为6.5。采用优化的培养基及发酵方案,当底物为粗制鸡胆粉时,发酵3.5 h后停罐并停止通气,于16℃静置12 h;当底物为精制鸡胆粉时,发酵5 h后停罐并停止通气,于25℃静置12 h;5.用D101大孔树脂纯化发酵液,先用水冲至洗脱液无色,再用95%乙醇洗脱至洗脱液无色,收集95%乙醇洗脱液50℃进行减压蒸发至粘稠状,将粘稠液过0.45μm的有机滤膜,滤液放入50℃真空干燥箱干燥至恒重,所得发酵产物取出捣碎即人工熊胆粉制品。以粗制鸡胆粉为底物制备的人工熊胆粉,回收率可达92.84±4.21%,以精制鸡胆粉为底物制备人工熊胆粉,回收率为91.83±2.56%;6.本工艺所制得的所有样品含水量均小于6%,内毒素含量低于0.015 EU/m L。结论:本研究实现以廉价易得的富含TCDCA鸡胆粉为底物,通过含有7α-羟基类固醇脱氢酶（7α-hydroxysteroid dehydrogenase,7α-HSDH）和7β-羟类固醇脱氢酶（7β-hydroxysteroid dehydrogenase,7β-HSDH）的大肠杆菌工程菌BL-pα1β2地生物催化,制备出符合天然熊胆粉中TUDCA与牛磺鹅去氧胆酸（tauroursodesoxycholic acid,TCDCA）比例在0.82～1.76（平均1.1±0.3）之间的人工熊胆粉制品,提供了一种实用的大规模发酵工艺,具有环境友好、经济、生物转化可控等特点。二、丹酚酸在酿酒酵母中的生物合成途径优化目的:设计一条完整的生物合成途径并将其构建至酿酒酵母中,通过对途径中所有基因进行活性筛选,简单的工艺优化后放大至发酵罐发酵,从而建立不需要额外添加底物、从头合成迷迭香酸的生物合成工艺。方法:1.针对所构建的RA生物合成途径所产生的具有对照化合物的中间产物及终产物建立LC-MS MRM模式的检测方法。2.将实验室前期构建好的含有八个基因的三个质粒分别共转至W303a和BY4742两种菌株之中,比较何种宿主更利于外源八个基因的表达。3.优化发酵工艺参数包括p H、温度和培养基。p H值通过不同比例的磷酸盐缓冲溶液（PBS）调节,从4.5至7.0每隔0.5设置一个实验点;温度从10℃至30℃每隔5℃设置一个实验点。采用正交法对培养基中碳源与氮源进行优化,所有实验均用LC-MS的方法监测发酵过程中的中间产物与目标产物。4.将彩叶草和丹参来源的TAT和HPPR共4个基因以正交组合的方式两两组合,构建至酵母菌中得到四株新菌株,以酪氨酸为底物进行发酵,通过比较发酵液中p HPL的含量进行活性筛选。5.将酵母工程菌株YW-S3C3FG上发酵罐发酵,并测定最终发酵产物的含量。结果:1.建立完善的LC-MS MRM模式的检测方法。2.宿主菌株选择的结果显示外源基因在W303a中活性更佳。3.根据中间产物含量的测定最终确定30℃为最佳的发酵温度,通过酵母菌密度判断p H5.5最适于工程酵母生长,最终选取葡萄糖和蛋白胨为碳源与氮源。4.基因活性筛选结果表明彩叶草来源的HPPR活性更佳,将前期构建中用到的Sm HPPR基因进行替换,得到带有均经过活性筛选的八个外源基因的酵母菌株YW-S3C3FG。5.LC-MS检测结果为上罐发酵迷迭香酸含量为0.64 ng/m L,并检测到丹酚酸B。结论:本研究完善了整个合成途径基因活性筛选,建立了精密稳定的多反应检测扫描的质谱检测方法,通过发酵工艺条件优化简化了发酵工艺并放大了发酵体积,不仅为迷迭香酸的来源提供了新的途径,打开了丹酚酸B生物合成的大门,还为如何利用底盘细胞内源酶与外源生物合成途径互作提供了新的思路。