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背景:恶性肿瘤严重危害人类的健康,目前肿瘤主要的传统治疗方法有手术、放疗和化疗。近年来免疫治疗已逐渐成为肿瘤治疗领域的焦点,其中免疫细胞过继治疗成为研究的热点,基于嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR T)的免疫疗法已经证明是一种有希望的癌症治疗策略,嵌合抗原受体T细胞通过基因工程技术使识别肿瘤特异性抗原的受体表达在T细胞表面,绕过抗原提呈阶段以及MHC的限制对肿瘤产生杀伤作用。2017年FDA已批准两个CAR T分别用于急性淋巴细胞白血病和特定类型非霍奇金淋巴瘤。CAR T对于实体瘤的应用仍受到一定的限制,CAR T治疗过程中存在脱靶效应、胞外段单链抗体结合抗原能力弱及产生免疫原性、利用慢病毒等方法制备CAR T细胞引起的插入突变等问题。因此,选择更特异性的靶标、结合能力更强的抗体,制备安全有效的CAR T细胞是当前急需解决的问题。Endoglin(CD105)是相对分子量为180 k Da的同型二聚体细胞膜糖蛋白,被认为是新生血管内皮细胞的特异标志分子之一,表达于实体肿瘤新生血管及相关肿瘤细胞表面,因此以CD105为靶点构建CAR T细胞为肿瘤免疫治疗提供一个选择。纳米抗体仅由Camilidae的重链抗体的VHH结构域组成,不具有轻链,这些单一的抗原结合结构域容易表达并保留对特定抗原的亲和力。前期研究成功筛选出CD105纳米抗体,该纳米抗体能与肿瘤细胞表面抗原CD105分子特异性性结合,能否通过构建该纳米抗体的CAR T细胞增强抗肿瘤作用仍需进一步研究。目的:探索构建CD105纳米抗体CAR T细胞的方法,探索CD105 CAR T细胞体外增殖活性及对靶细胞的杀伤作用,体内对NOD/SCID鼠荷肝癌细胞移植瘤的生长抑制作用,初步探讨CD105 CAR T细胞抗肿瘤作用及机制,为肿瘤过继免疫细胞治疗提供新的依据。方法:1.针对19号染色体AAVS1位点的PPP1R12C基因设计g RNA,构建CRISPR/Cas9载体,用T7E1方法验证设计的g RNA是否具有切割作用。构建胞外段含有CD105纳米抗体,共刺激分子为4-1BB及结构域为CD3ζ的二代CARs分子载入p LVX表达载体中,用双酶切进行鉴定。用PCR方法获取CAR片段,将CAR片段与Puc-MdonorAAVS1载体连接,构建两端带有1kb左右同源臂的外源基因的同源同组载体Puc-Mdonor-AAVS1-CAR。2.将CRISPR/Cas9载体和同源重组载体采用电转染的方式导入到T淋巴细胞中构建CAR T细胞,细胞经过培养后用DNA提取试剂盒提取细胞DNA,PCR法验证CAR片段及左右同源臂,利用荧光显微镜观察是否有GFP的表达,流式细胞仪检测T细胞荧光GFP的表达率及分析CAR T细胞的CD4+CD8+比例。3.经电转染获得CD105 CAR T细胞、CD19 CAR T细胞、Mock组T细胞,通过流式细胞仪检测CAR T细胞经过靶细胞刺激后的增殖情况,表面活性分子CD25、CD69,记忆分子CD62L,耗竭分子PD-1的表达以及溶酶体蛋白(CD107a)等的表达。4.采用流式细胞仪检测CD105 CAR T细胞对肝癌细胞Bel7404、Hep G2、SMCC7721、MHCC97H的杀伤作用,ELISA法检测CD105 CAR T细胞分泌细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10等)的含量,ELISPOT检测CAR T细胞经靶细胞刺激后分泌IFN-γ的细胞数量。5.构建NOD/SCID鼠荷肝癌移植瘤模型(Bel7404及MHCC97H模型),经尾静脉注射CAR T细胞和未电转T细胞,共治疗2次,检测重组CAR T细胞体内杀伤肿瘤的能力,通过测量小鼠瘤体积大小,观察小鼠的生存率等指标判定CAR T细胞在体内的抗肿瘤作用。6.当瘤长度达15mm时取瘤做石蜡切片,免疫组织化学染色法检测肿瘤组织中细胞增殖情况(Ki67),检测肿瘤组织中的血管密度(CD31),检测肿瘤组织中的凋亡蛋白(Bax)的表达,Tunel法检测肿瘤组织中凋亡细胞的数目,检测肿瘤组织中CD3的含量等研究CAR T细胞抗肿瘤机制。结果:1.构建了CRISPR及Donor载体,运用CRISPR/Cas9技术制备CAR T细胞,PCR法验证CAR片段及左右同源臂在T细胞基因组中成功表达,荧光显微镜观察到GFP的表达,流式细胞仪检测T细胞荧光GFP的表达率在20%以上,表明成功制备CAR T细胞。2.CD105 CAR T细胞经靶细胞抗原刺激后能促进T细胞的增殖,促进表面活化分子(CD25、CD69)、记忆分子(CD62L)及溶酶体蛋白CD107a的表达。CD105 CAR T细胞分泌细胞因子IFN-γ,TNF-α量增多,高于其他对照组,IL-10的分泌无差异。3.在不同的效靶比下,随着效靶比的增大,杀伤作用增强,CD105 CAR T细胞对靶细胞(Bel7404、Hep G2、SMCC7721)杀伤作用显著高于对照组CAR T细胞,对高表达CD105细胞(Bel7404、Hep G2、SMCC7721)的杀伤效率高于低表达CD105的靶细胞(MHCC97H),但是对于MHCC97H的杀伤效率与对照组没有显著的差异。4.CD105 CAR T细胞对正常小鼠组织器官无毒性,用CD105 CAR T细胞治疗荷肝癌NOD/SICD小鼠,CD105 CAR T细胞对CD105高表达及CD105低表达移植瘤均有一定的治疗作用,对CD105高表达移植瘤的治疗效果高于CD105低表达移植瘤,肿瘤生长受到抑制,延长小鼠的生存时间。5.免疫组织化学检测表明CD105 CAR T细胞能抑制肿瘤组织细胞增殖,降低肿瘤中血管密度,促进凋亡蛋白表达,凋亡细胞数量增多,并且小鼠瘤组织中有少量T淋巴细胞浸润,提高CD105 CAR T细胞的抗肿瘤作用。结论:研究结果显示,用CRISPR/Cas9技术在AAVS1位点成功构建CD105纳米抗体CAR T细胞,CD105CAR T细胞在体内体外具有一定的抗肿瘤作用,CD105 CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用跟CD105的表达量有关,为肿瘤的过继治疗提供了新策略。