目的：　　艾滋病是一种严重危害人类生命健康的致死性慢性传染病，虽然至今还没有有效的疫苗，但大量研究证实CD8+T细胞介导的CTL应答在疾病的控制过程中起了重要作用。急性期CTL应答的出现伴随着病毒载量的明显下降，并在很大程度上决定着病毒调定点水平的高低。近年来，男男同性(men who have sex with men，MSM)传播方式增长迅速，同时基于人群水平的分子流行病学研究表明，在中国MSM感染者中CRF01 AE亚型已经成为主要流行亚型。虽然关于欧美及高加索人群中流行的B、C亚型病毒的CTL应答已经有了广泛而深入的研究，但不同病毒亚型及不同感染人群CTL应答特征及控制疾病的方式不尽相同，中国男同人群中CRF01 AE亚型CTL应答特征及控制疾病的方式尚不清楚，针对我国男同人群CTL疫苗的研究仍缺乏基础资料的支持，因此急需对这部分人群进行急性期CTL应答的研究，以明确中国男同人群中CRF01 AE亚型CTL应答特征，同时探索与疾病控制相关的因素。　　我们在前期研究的基础上设计合成了CRF01_ AE亚型传播簇特异性的Gag、Pol、Nef区段的重叠肽段及部分HLA型别限制的最佳表位，对15例CRF01 AE亚型HIV-1急性感染者进行动态CTL应答的研究，同时获得了动态Gag克隆序列，我们发现在CRF01 AE亚型的MSM感染者中，针对Gag区段表位产生持续的免疫显性应答可以有效控制病毒，为基于中国CRF01 AE亚型MSM患者的疫苗设计提供了理论基础。　　材料和方法：　　1、研究对象　　从2008年开始对辽宁大规模MSM高危人群队列进行定期随访并进行血清学ELISA筛查实验和Western Blot确认实验，对血清学阴性者进行集合核酸检测，满足以下一项或多项者:1）在3个月内HIV抗体开始变阳性者;2）HIV抗体阴性但HIV RNA阳性者;3）HIV抗体弱阳性但在两周之内可以重复并OD值较前次升高者;4）WB抗体检测少于4条蛋白条带者，认定为新发感染者。HIV新发感染者感染时间的估计方法为:患者核酸检测阳性前14天作为HIV感染时间，初筛阳性患者以此次阳性与末次阴性的中间时间作为HIV感染时间，有可靠高危性行为史的患者结合高危行为史判定。本研究共对15例新发感染者感染3个月点和1年点PBMC和血浆样本进行纵向研究。　　2、肽段合成　　根据前期获得的50余条辽宁新发CRF01_ AE亚型第二簇的全长序列，利用BioEdit软件合成共享氨基酸序列，然后用HIV Database中PeptGen PeptideGenerator软件生成长度为17-18mer，10个氨基酸overlap的Gag、Pol、Nef的重叠肽段，合成CRF01 AE亚型第二簇肽段（Sigma-Aldrich，美国）。同时合成了中国人群中较为常见的HLA-Ⅰ类等位基因A02、A11、A24、B13、B40、B51限制的已发表的最佳表位，及具有明确保护性作用的B27限制的KK10表位，所有表位均按照CRF01 AE亚型中序列进行合成。　　3、Elispot肽库筛查及单肽确认　　采用14×16的二维矩阵肽库对Gag、Pol、Nef区段肽段进行筛查，肽段反应终浓度为5μg/ml，每孔加入0.1million细胞。阳性判断标准为:大于50 SFC/106PBMC同时大于3倍阴性对照平均值。同时将筛查的肽库进行拆解，进行单肽确认实验。实验操作同上述ELISPOT筛查实验。反应结果的计算及阳性判断标准也与筛查实验相同。　　4、Elispot最佳表位实验　　对具有HLA-Ⅰ类等位基因A02、A11、A24、B13、B27、B40、B51的个体，将相应HLA型别限制的最佳表位进行Elispot实验，实验操作同上述筛查实验。反应结果的计算及阳性判断标准也与筛查实验相同。　　5、DNA提取　　外周血DNA的提取，使用1ml EDTA抗凝外周静脉血，采用QIAamp DNAMini试剂盒，按照试剂盒说明书标准方法快速提取全基因组DNA200μl。将纯化后的DNA置-20℃保存备用。　　6、HLA等位基因分型检测　　HLA分型采用PCR-SSP方法，采用One Lamda公司的Micro SSPTM试剂盒。　　7、Gag克隆　　1) HIV-1基因组RNA提取　　病毒基因组RNA使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAgen，German)按操作说明从血浆标本提取基因组RNA，-80℃保存备用。　　2) Nested-PCR Gag基因扩增及TA克隆测序　　采用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)扩增Gag全长。第一轮外侧引物172A(5-ATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3628-648 nt of HIV-1 HXB2)和 Gag-6(5-TAATGCTTTTATTTTYTCTTCTGTCAATGGC-32651-2621 nt ofHIV-1 HXB2)，第二轮内侧Gag-763(5-TGACTAGCGGAGGCTAGAAGG-3763-783nt of HIV-1 HXB2)和Gag-5(5-TTCCYCCTATCATTTTTGGTTTCC-32377-2400nt of HIV-1 HXB2)。扩增条件:第一轮:50℃，30min;94℃变性5 min;94℃30s，50℃30s，72℃2min3个循环;94℃30s，55℃30s，72℃2min32个循环;72℃延伸10min;4℃保温。第二轮:94℃变性5min;94℃30s，55℃30s，72℃2min30个循环72℃延伸10min;4℃保温。1％琼脂糖凝胶电泳后，对比MARKER切下1600bp阳性片段，QIAgen胶纯化试剂盒按照操作说明纯化回收目的基因片段。纯化产物以40ul去离子水洗脱。将其连接入TOPO载体克隆后获得每一个患者的Gag序列，并进行测序分析。　　8、统计学分析　　应用SPSS17.0进行统计学分析，采用应用Mann-Whitney U test检验对CD4计数、病毒载量、setpoint进行分析，P＜0.05认为有统计学差异。　　结果：　　1、15例样本基本临床信息　　本研究共纳入15例新发感染者，均为MSM感染者，且均为CRF01_AE亚型第二簇。在感染1年点时平均CD4计数和病毒载量较3个月点时均有所下降，但均无统计学差异(p＞0.05)。15例患者中A02、B15、B13、C03等位基因频率较高。　　2、3个月点和1年点CTL应答的特征　　通过分析15例患者感染3个月点和1年点不同蛋白的应答频率发现，各区段蛋白在3个月点的应答频率整体低于1年点时的应答频率，其中P17、P24、RT和Nef区在3个月点和1年点应答频率均较高，在3个月点这4个区段应答频率均大于40％，在1年点应答频率均大于65％，而P15、GP/TF、PR和IN区应答频率相对较低，在3个月点及1年点应答频率均小于30％。通过强度分析发现，各区段蛋白在3个月点的平均应答强度同样整体弱于1年点时的平均应答强度，P24、RT和Nef区在3个月点和1年点平均应答强度均较强，在3个月点这3个蛋白区段平均应答强度均大于600 SFU/106 PBMC，在1年点平均应答强度均大于1200 SFU/106 PBMC，而P15、GP/TF、PR和IN区应答强度相对较弱，在3个月点和1年点平均应答强度均小于200 SFU/106 PBMC。　　3、不同个体呈现不同的免疫显性应答模式　　结合单肽确认信息、最佳表位反应信息、Gag克隆序列对3个月点和1年点样本进行纵向分析，发现不同患者呈现不同的免疫显性应答模式。按照不同的免疫显性应答模式，15例患者可以分成2个组。第一个组为在3个月点和1年点均针对同一区段表位产生免疫显性应答的患者，其中320009、320669、320016和3250204例患者均呈现持续的Gag区段表位的免疫显性应答，这4例患者setpoint均较低(＜3.6 copies/ml)，320353和4401052例患者均呈现持续的Pol区表位的免疫显性应答，这2例患者的setpoint分别为4.30 copies/ml和4.61 copies/ml，320088、320018、440020、3209754例患者均呈现持续的Nef区段表位的免疫显性应答，这4例患者setpoint较高(＞4.4 copies/ml)，其中320018、440020、3209753例患者setpoint均＞5 copies/ml。第二组为在3个月点和1年点针对不同区段表位呈现免疫显性应答的患者，其中320135和3211372例患者均在3个月点针对Gag区段表位呈现免疫显性应答，在1年点时Gag区段表位应答强度下降，同时产生针对Nef区段表位免疫显性应答。320842和3004302例患者均在3个月点针对Pol区表位呈现免疫显性应答，而在1年点时均针对Gag区段表位产生免疫显性应答。320019患者在3个月点针对Nef区段表位产生免疫显性应答，在1年点时针对Nef区段表位应答强度下降，同时产生针对Gag区段表位免疫显性应答。在这5例患者中，320135患者setpoint为3.75 copies/ml，其余4例患者setpoint在4.29-4.62 copies/ml之间。　　4、持续的Gag区段表位的免疫显性应答可以有效控制病毒　　通过对不同个体免疫显性应答模式及动态变化分析发现，有持续Gag区段免疫显性应答的个体其setpoint要显著低于无持续Gag区段免疫显性应答的个体(p=0.001)，有持续Nef区段免疫显性应答的个体其setpoint要显著高于无持续nef区段免疫显性应答的个体(p=0.018)，而有无持续Pol区段免疫显性应答的个体其setpoint无显著差异(p=0.8)。　　5、Gag区段表位免疫显性应答驱动病毒变异　　通过分析6例在3个月点针对Gag区段表位产生免疫显性应答的患者其免疫显性表位序列纵向的变异情况发现，6例患者在3个月点均针对不同的Gag区段表位产生免疫显性应答，其中仅有320669患者针对的B27限制的KRWIILGLNK(KK10 Gag263-272)表位在1年点时仍呈现免疫显性应答，其余5例患者在3个月点时呈现免疫显性应答的表位在1年点时虽仍有应答但均不是免疫显性应答。序列分析发现，仅有320669患者针对的B27限制的KRWIILGLNK(KK10 Gag263-272)表位和320135患者针对的B13限制的GQMREPRGSDI(GI11 Gag226-236)表位序列未发生变异，其余4例患者在1年点时免疫显性表位序列均发生了较大程度的变异(≥50％)。同时320135患者针对的B13限制的GQMREPRGSDI(GI11 Gag226-236)表位序列虽未发生变异，但表位侧区序列在1年点时发生了V210A的变异，提示Gag区段表位免疫显性应答会对病毒造成较强的免疫压力。　　结论：　　1、在CRF01_AE亚型中Gag、Pol、Nef区段蛋白在3个月点的应答频率和应答强度整体均低于1年点时的应答频率和应答强度。P24、RT和Nef区在3个月点和1年点应答频率和强度均较高。　　2、CRF01_ AE亚型MSM人群中持续的Gag区段表位免疫显性应答与低setpoint相关，可以较好控制病毒;持续的Nef区段表位免疫显性应答与高setpoint相关，不能控制病毒复制。