论文部分内容阅读
研究背景:本实验室的前期研究发现,在阵间觉醒时达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)的趾长伸肌和比目鱼肌肌纤维中游离钙离子浓度相比于冬眠前都出现了显著的升高(56%和119%),但其具体的分子调控机制尚未明了。研究认为,胞浆的钙离子浓度升高主要来自于细胞钙库内质网中钙离子的释放。雷诺定受体1型(ryanodine receptor 1,RYR1)是骨骼肌肌浆网上跨膜的受体通道蛋白,它既是胞内第二信使的受体又是肌浆网上主要的钙释放通道。RYR1受到多种调控信号影响,其中最主要的是在三联管上与其偶联的二氢吡啶受体(dihydropyridine receptor,DHPR)和胞浆内的环腺苷二磷酸核糖(cyclicADP-r bose,cADPR)。DHPR是位于骨骼肌横管膜上的电压感受器,当细胞受到刺激时,DHPR感受到电压变化发生变构,开放细胞膜L型钙通道使胞外钙离子内流造成胞浆钙离子浓度的升高;同时DHPR的变构也激活了与其偶联的RYR1发生变构,开放钙释放通道使肌浆网内的Ca2+外流入胞质,也会造成骨骼肌纤维胞浆钙离子浓度的升高,其中DHPR和RYR1的位置偶联关系是实现肌浆网钙离子释放的关键。哺乳动物细胞内的cADPR 是由 ADP 核糖环化酶 CD38(cluster of differentiation 38,分化抗原簇 38)将NAD+水解环化生成并转运至细胞内的,CD38是一个细胞膜上的跨膜糖蛋白,受到胞外刺激后可以环化ADP核糖生成cADPR,cADPR作为第二信使可以诱导RYR1释放钙离子进入胞质。Caveolin-1(细胞膜小窝蛋白1)是一个细胞膜骨架蛋白,是细胞膜穴样内陷的标志性分子,在细胞膜重塑过程中有重要作用。本实验室前期关于冬眠达乌尔黄鼠骨骼肌的蛋白组学研究发现,出眠时黄鼠趾长伸肌中Caveolin-1的表达量比冬眠前显著减少,且有研究证实Caveolin-1的沉默会减弱DHPR和RYR的偶联关系,但其具体调控机制尚未明确。本研究将对冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌中RYR1及其上游主要调控因子DHPR和CD38、以及Caveolin-1的基因和蛋白表达水平和DHPR和RYR1的共定位系数进行测定,来探究RYR通道在冬眠黄鼠骨骼肌维持钙稳态机制中的作用。研究目的:1.通过观察和比较不同体重和性别对达乌尔黄鼠冬眠阵频率的影响,研究个体差异对冬眠生理研究的影响。2.通过比较冬眠不同时期达乌尔黄鼠比目鱼肌和趾长伸肌中RYR通道及其主要调控因子DHPR和CD38的基因、蛋白表达和RYR1蛋白定位的变化,研究冬眠过程中RYR通道在骨骼肌纤维钙稳态维持中的作用。3.通过比较冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌中Caveolin-1的mRNA和蛋白表达量的变化,探索Caveolin-1在冬眠黄鼠骨骼肌钙稳态维持机制中的可能作用。研究方法:1.实时荧光定量PCR:测定比目鱼肌和趾长伸肌中RYR1、DHPR、CD38和Caveolin-1 mRNA的相对表达量;2.免疫荧光组织化学:测定比目鱼肌中RYR1和slow-myosin、趾长伸肌中RYR1和fast-myosin以及两块肌肉中RYR1和DHPR共定位系数的变化;3.Western blot:测定比目鱼肌和趾长伸肌中CD38和Caveolin-1蛋白的相对表达量。研究结果:1.黄鼠体重和性别对冬眠阵频率的影响体重不同的黄鼠经历数月的冬眠期,其冬眠阵间觉醒次数有些许差异,但无统计意义(P>0.05),体重与阵间觉醒次数之间亦无线性关系。雄性黄鼠的冬眠阵间觉醒次数略高于雌性,但不具统计意义(P>0.05)。2.冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌中RYR1和DHPR的mRNA表达变化及蛋白共定位关系黄鼠趾长伸肌纤维中RYR1 mRNA的相对表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 357.77%(P<0.001)和741.04%(P<0.001),出眠组相比于阵间觉醒组降低了 83.01%(P<0.001)。DHPRmRNA的相对表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 1312.3%(P<0.001)和1234.94%(P<0.001),出眠组相比于阵间觉醒组降低了 99.09%(P<0.001)。黄鼠比目鱼肌纤维中RYR1 mRNA的相对表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 202.7%(P<0.001)和1513.4%(P<0.001),出眠组相比于阵间觉醒组降低了 85.24%(P<0.001)。DHPRmRNA的相对表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 81.94%(P<0.05)和168.04%(P<0.01)。出眠组相比于阵间觉醒组降低了 75.56%(P<0.01)。黄鼠趾长伸肌中RYR1与fast-myosin共定位系数:阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别降低了 27.4%(P<0.05)和62.17%(P<0.001),出眠组相比于阵间觉醒组升高了 155.71%(P<0.001)。RYR1与DHPR共定位系数:阵间觉醒组相比于冬眠中组升高了 16.59%(P<0.05)。出眠组相比于阵间觉醒组降低了38.97%(P<0.001)。黄鼠比目鱼肌中RYR1与slow-myosin共定位系数:冬眠中组相比于冬眠前组升高了 63.79%(P<0.01),其余各组间无显著差异(P>0.05)。RYR1与DHPR共定位系数:各组间无显著差异(P>0.05)。3.冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌中CD38的mRNA和蛋白表达变化黄鼠趾长伸肌纤维中CD38mRNA的相对表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 743.74(P<0.001)和482.19%(P<0.001)。出眠组相比于阵间觉醒组降低了 97.27%(P<0.001)。CD38的蛋白表达量在阵间觉醒组相比于冬眠中组降低了 50.63%(P<0.01)。黄鼠比目鱼肌纤维中CD38 mRNA的相对表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 367.74%(P<0.001)和1184.22%(P<0.001),出眠组相比于阵间觉醒组降低了 93.75%(P<0.001)。CD38蛋白表达量在阵间觉醒组相比于冬眠中组降低了 50.43%(P<0.01),出眠组相比于阵间觉醒组升高了249.31%(P<0.001)。4.冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌中Caveolin-1的mRNA和蛋白表达变化黄鼠趾长伸肌纤维中Caveolin-1 mRNA的相对表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 758.88%(P<0.001)和968.44%(P<0.001)。出眠组相比于阵间觉醒组降低了 81.46%(P<0.001)。Caveolin-1的蛋白表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 192.47%(P<0.001)和72.51%(P<0.001)。出眠组相比于阵间觉醒组降低了 80.53%(P<0.001)。黄鼠比目鱼肌纤维中Caveolin-1 mRNA的相对表达量在冬眠中组、阵间觉醒组和出眠组相比于冬眠前组分别升高了 174.81(P<0.001)、162.49(P<0.001)和83.17%(P<0.001)。Caveolin-1的蛋白表达量在阵间觉醒组相比于冬眠前组和冬眠中组分别升高了 73.22%(P<0.05)和 54.88%(P<0.05)。研究结论:1.达乌尔黄鼠的体重和性别差异对冬眠阵频率和冬眠动物生理研究没有显著影响。2.阵间觉醒时比目鱼肌与趾长伸肌中RYR1和DHPR的基因表达水平和共定位系数均出现显著上调,可能是造成胞浆钙离子浓度升高的主要原因。3.在阵间觉醒时CD38的基因表达出现了储备性上调,但CD38对RYR的调控在冬眠黄鼠骨骼肌中不是主要因素。4.阵间觉醒时Caveolin-1表达的升高可能是造成RYR1和DHPR共定位系数上调的原因,Caveolin-1可能参与了黄鼠冬眠期间趾长伸肌纤维钙稳态的调节。