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伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus PRV)引起的家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒、呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染病，妊娠母猪可发生死胎和流产，是危害养猪业的一个重要传染病。PRV作为一种疱疹病毒，拥有庞大的基因组和许多非必需区，具有用作表达外源基因的巨大潜力，被认为是理想的活疫苗载体。PRV的蛋白激酶(PK)基因是PRV体外生长和复制的非必需基因，却是病毒神经毒力的必需成分。通过诱变或基因工程技术使PK基因灭活后，病毒的毒力显著降低，但其免疫原性没有改变，因此PK基因是外源基因的理想插入区之一。 本试验以伪狂犬病毒TK／gI缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA，用限制性内切酶Asc Ⅰ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7kb片段，将此片段克隆入pPoly Ⅱ载体的Asc Ⅰ多克隆位点获得中间载体P8-AA。用限制性内切酶SphⅠ+Nde Ⅰ缺失质粒P8-AA中PK基因的2218bp片段，在此缺失区插入质粒pEGFP-G中含绿色荧光蛋白基因和狂犬病病毒糖蛋白基因(G)的完整表达盒。构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-G(正)和P8-EGFP-G-r(反)；P8-AA质粒缺失PK基因之后在其缺失部位克隆入EGFP基因的完整表达盒构建出通用转移载体P8-EGFP(正)和PS-EGFP-r(反)质粒。 将六种质粒pEGFP-cl，pEGFP-G，P8-EGFP(正)，P8-EGFP-r(反)，P8-EGFP-G(正)，P8-EGFP-G-r(反)，分别在长有70％PK细胞的六孔细胞培养板上做瞬时转染，观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果质粒pEGFP-cl，pEGFP-G，P8-EGFP-r(反)，P8-EGFP-G-r(反)均出现强弱程度不同的荧光，上述结果说明质粒P8-EGFP-r(反)，P8-EGFP-G-r(反)可以实现绿色荧光蛋白基因的瞬时表达，因此作为通用转移载体是可行的，可以用于同源重组。同时也说明质粒P8-EGFP和P8-EGFP-G的两侧同源重组臂中存在负调控序列，抑制了正向质粒的EGFP基因表达，至于负调控序列的位置和作用机理还有待于进一步研究。将PRV TK／gI缺失疫苗株基因组DNA与转移载体P8-EGFP-G-r DNA共转染PK-15细胞，出现病变后在荧光显微镜下观察到绿色荧光，经三次蚀斑克隆纯化筛选到重组病毒，将重组病毒命名为PRV-PK~--G。