抗转铁蛋白受体抗体新型分子的构建及其生物学特性研究

来源 :华中科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dxlwwh
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的利用抗TfR抗体能与肿瘤细胞表面高表达的TfR结合的特点,构建抗TfRmAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒,观测其靶向肿瘤效应。利用多聚阳离子多聚乙酰亚胺(PEI)能够耦联带负电荷DNA的特点,构建末端带阴性寡肽尾的抗TfR-scFv-D4S×5双功能分子与PEI/DNA结合。鉴定这类抗TfR抗体新型分子与肿瘤细胞结合的特异性和生物学活性,为肿瘤的靶向定位、示踪、显像和靶向治疗研究奠定基础。方法1.抗TfRmAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒的构建:①运用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗TfR mAb, BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE鉴定其纯度,FCM鉴定其与TfR的结合活性;②Traut’s试剂活化抗TfR mAb二硫键,与带有DSPE-PEG(2000)-Maleimide双功能基团的PEG/DIR-BOA纳米颗粒混合孵育,构建抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒。2. FPLC纯化PEG/DIR-BOA纳米颗粒和抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒,去除游离杂质。3.利用抗TfR mAb, FCM技术检测不同细胞(CHO、L02、HepG2、HT1080)表面TfR的表达,利用PEG/DIR-BOA内米颗粒具有能与细胞表面SRBⅠ结合的多肽,FCM技术检测不同细胞(HepG2、HT1080)表面SRBⅠ的表达。4.利用肿瘤细胞HT1080表面TfR和SRBⅠ的表达特点,FCM检测抗TfRmAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒与肿瘤细胞HT1080的靶向结合活性。5.利用生物信息学分析设计,采用重叠延伸PCR全合成适合于大肠杆菌表达的基因,通过酶切、连接等基因工程技术设计和构建不同表达载体的抗TfR-scFv-D4S×5质粒:①pET28a-6×His-scFv-D4S×5;②pET28a-scFv-D4S×5-6×His;③pGEX4T3-GST-scFv-D4S×5-8×His;④pAB1-scFv-D4S×5-6×His。6.经IPTG诱导,原核表达抗TfR-scFv-D4S×5,12%SDS-PAGE、Western-blot鉴定不同表达载体蛋白表达。7.常规提取可溶性蛋白或溶解包涵体,采用Ni-NTA agrose纯化蛋白,收集纯化产物经12%SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定。8.包涵体纯化产物透析复性。9.FCM检测抗TfR-scFv-D4S×5与肿瘤细胞HepG2、K562结合活性。10.FCM检测抗TfR-scFv-D4S×5在肿瘤细胞K562的内吞效率,荧光显微镜检测内吞活性。11.非变性梯度凝胶电泳鉴定抗TfR-scFv-D4S×5与PEI/DNA的结合活性。结果1.BCA法测定抗TfR mAb蛋白浓度约为7.5mg/mL,SDS-PAGE在55KD和25KD处可见明显条带,与理论值相符,且产物纯度可以达到90%以上。2.FCM检测,抗TfR mAb与肿瘤细胞HepG2的结合率可达到90%左右,说明抗TfR mAb能与高表达TfR的肿瘤细胞特异性结合。3.FCM检测发现,CHO细胞不表达TfR,L02细胞TfR表达量相对较低约为16.3%左右,肿瘤细胞HepG2和HT1080表达量相对较高,分别为90%和67%左右。FCM检测同时发现,HT1080细胞表面SRBⅠ表达量相对较低约为2.9%左右,而HepG2细胞表面表达量相对较高,约为60%左右。4.FCM检测发现,缺乏TfR靶向性的PEG/DIR-BOA纳米颗粒与肿瘤细胞HT1080结合率仅为2.9%左右,而抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒与高表达TfR的肿瘤细胞HT1080结合率提高约3倍,为9.5%左右,封闭HT1080表面TfR,抑制抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA纳米颗粒与TfR结合发现其结合率下降至3.6%。5.提取pET28a-6×His-scFv-D4S×5质粒,NdeⅠ、BamHⅠ双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳,结果可见约828bp和5300bp片段,与预期值符合;提取pAB 1-scFv-D4S×5-6×His质粒,NcoⅠ、XhoⅠ双酶切,结果可见约819bp和3000bp左右片段,与预期值符合。测序分析结果分别与预期匹配,表明表达载体构建成功。6.37℃诱导表达条件下,诱导转化了pET28a-6×His-scFv-D4S×5表达载体的BL21菌,经12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在31KD处有目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达,且表达产物以包涵体的形式存在。经Ni-NTA agrose纯化,12%SDS-PAGE检测纯化成功,BCA法测定复性后蛋白浓度约为2mg/ml。7.37℃诱导表达条件下,诱导转化了pET28a-scFv-D4S×5-6×His表达载体的BL21菌,经12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在31KD处有目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达,且表达产物以包涵体的形式存在。经Ni-NTA agrose纯化,12%SDS-PAGE检测纯化成功。8.37℃诱导表达条件下,诱导转化了pGEX4T3-GST-scFv-D4Sx5-8xHis表达载体的BL21菌,经12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在55KD处有携带GST标签目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达,且表达产物大部分以包涵体的形式存在。Ni-NTA agrose纯化,12%SDS-PAGE检测纯化成功。25℃诱导12h表达条件下,12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在55KD处有携带GST标签目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达,表达产物可溶性蛋白有增加,但包涵体表达仍相对较多。9.37℃诱导表达条件下,诱导转化了pAB1-scFv-D4Sx5-6xHis表达载体的BL21菌,经12%SDS-PAGE和Western-blot检测发现,在34KD处有携带信号肽的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表达。25℃诱导表达条件下,表达产物中可溶性蛋白表达稍有增加,但包涵体表达仍相对较多。10.比较pET28a-6×His-scFv-D4S×5和PET28a-scFv-D4S×5-6×His表达载体BL21菌诱导表达的包涵体蛋白复性后的抗TfR-scFv-D4S×5 pGEX4T3-GST-scFv-D4S×5-8×His诱导表达的可溶性蛋白抗TfR-scFv-D4S×5三类不同表达载体表达的抗TfR-scFv-D4S×5活性,FCM检测发现,pET28a-6×His-scFv-D4S×5表达载体BL21菌表达的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5能与高表达TfR的肿瘤细胞HepG2结合,结合率可达到80%左右,而另外两类表达载体表达的抗TfR-scFv-D4S×5几乎没有结合活性。11.FCM检测发现,pET28a-6×His-scFv-D4S×5表达载体BL21菌表达的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5同时能与高表达TfR的肿瘤细胞K562结合,结合率可达到80%左右。荧光显微镜观察进一步发现,抗TfR-scFv-D4S×5与TfR特异性结合后在受体介导的内吞作用下进入细胞,FCM检测内吞率可达到42.6%。12.非变性梯度凝胶电泳证明,在多聚阳离子多聚乙酰亚胺(PEI)介导的静电作用下,这种末端携带阴性寡肽尾的抗TfR-scFv-D4S×5双功能分子能与PEI/DNA结合,具备耦联带负电荷DNA的特点。结论1.成功构建抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向纳米颗粒,并证明其具有与肿瘤细胞HT1080表面TfR的靶向结合活性,为TfR受体介导的肿瘤靶向定位、示踪、显像、靶向治疗研究奠定了良好的基础。2.利用生物信息学分析设计,采用重叠延伸PCR全合成适合于大肠杆菌表达的基因,通过基因工程技术成功构建TfR-scFv-D4S×5原核表达载体,其表达量显著高于原鼠源性亲本抗体基因密码子序列,并且证明表达产物抗TfR-scFv-D4S×5双功能分子既具备与肿瘤细胞表面TfR结合的活性和受体介导内吞作用,又可以在PEI的介导下,通过阴性寡核苷酸尾与质粒DNA结合。从而为抗TfR-scFv在肿瘤的靶向定位、示踪、显像,以及靶向生物治疗研究奠定了基础。
其他文献
目的探究药物缓释微球肝动脉化疗栓塞术治疗中晚期原发性肝癌对患者肝功能及血清AFP、CAl9-9、GGT的影响。方法回顾性分析广西中医药大学附属瑞康医院2018年4月至2019年3月收
【研究背景与目的】乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发病的独立高危因素。整合的HBV-DNA基因组编码的乙型肝炎病毒X
随着社会和经济的发展,我国的国民经济取得了显著的发展成绩,而在我国国民经济发展的过程中,现在物流业迅速的崛起,并占据较大的份额。在现代物流业发展的过程中,资源的大力
回 回 产卜爹仇贱回——回 日E回。”。回祖 一回“。回干 肉果幻中 N_。NH lP7-ewwe--一”$ MN。W;- __._——————》 砧叫]们羽 制作:陈恬’#陈川个美食 Back to yield
<正> 在戏曲教学中,以前辈艺术家的成功作品为范本,并运用与其相同的方法再现其艺术作品的学习方法,通常被称之为模仿。 戏曲的模仿与书法学习中的“描红模子”颇相近似,可两
水泥稳定碎石基层具有成型快、强度高、水稳定性好、抗疲劳能力强等优点,为目前许多高等级公路基层所采用,其施工工艺逐步走向成熟。但是在水稳基层的养护期,甚至后期路面交
回 回 产卜爹仇贱回——回 日E回。”。回祖 一回“。回干 肉果幻中 N_。NH lP7-ewwe--一”$ MN。W;- __._——————》 砧叫]们羽 制作:陈恬’#陈川个美食 Back to yield
1不重视春剪1.1不进行春季修剪由于冬剪一般留枝、留芽较多,因此在春季枝蔓萌芽前,应进行复剪。剪除对象是枯死枝条、风干残桩、病虫枝和多余的无用枝,使树体结构和枝条分布合理
作为一种全新的教学模式,翻转课堂的教学有效性问题还没有相关的研究成果。课题组通过开展高职英语翻转课堂的教学实验,运用"柯克帕特里克效果评估四层次模型",对教学的有效
合理整形是早果、早丰的关键。对株行距(1.5~2.0)m&#215;4.0m的密植苹果幼园采用“松塔型”整形方法能实现3a(年)成形,提前1a(年)进入结果期,提前2a(年)进入丰产期。现将其主要整形技术要点