巴贝斯虫病是一类经蜱传播的血液原虫病,虫体寄生在宿主红细胞中,会引起人和动物宿主发热、贫血、血尿,甚至死亡。田鼠巴贝斯虫(Babesia.microti)是最重要的人兽共患巴贝斯虫,感染多种动物并引起人巴贝斯虫病,年老者、摘除脾脏或免疫力低下的患者的感染后病情严重,可导致死亡。寄生在哺乳动物红细胞中的原虫,需要抵御活性氧类(ROS)或活性氮类(RNS)的毒性作用,因为这两类物质主要会引起虫体DNA的氧化损伤和脂质过氧化。因此,为了抵御氧化压力,寄生虫利用硫氧还蛋白系统来维持氧化还原平衡,这个系统包括NADPH、硫氧还蛋白(Trx)和NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)。恶性疟原虫的Trx系统的研究较为广泛,在巴贝斯虫中的研究还鲜有报道,因此,为了了解巴贝斯虫硫氧还蛋白系统的分子机制,筛选药物靶标,我们开展了对田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白系统中关键酶TrxR的研究。本研究结果包括以下四个方面:一、对红细胞期田鼠巴贝斯虫转录组测序结果进行分析,筛选出虫体在红细胞期重要的抗氧化通路的关键代谢酶——硫氧还蛋白还原酶。通过RACE方法获得全长编码基因,命名为Bmi TrxR基因,cDNA全长为1766 bp(已登录GenBank,编号KU845266),包括一个完整的开放阅读框1659bp,编码553个氨基酸。预测的蛋白分子量为58.4 kDa,等电点为6.95,信号肽序列为前18个氨基酸,预测蛋白的N端具有巯基二硫化物氧化还原活性中心(-CVNVGC-),C端包含一段保守性序列GCGGGKCG,这两段序列正是TrxR具有催化活性的结构域。BLAST非冗余数据库分析,结果显示预测蛋白与其他物种的TrxR具有显著的相似度,与牛巴贝斯虫和恶性疟原虫的氨基酸相似度分别为58%、53%。二、Bmi TrxR编码基因克隆到表达载体pET28a质粒中,然后转化到表达菌E.coli BL21。经诱导,重组蛋白成功地表达,分子量约为58.4 kDa,与预测的大小一致,重组蛋白经亲和层析柱纯化,制备小鼠抗血清。三、Western blotting结果发现,重组蛋白抗血清可识别虫体目的蛋白,大小为58.4 kDa;间接免疫荧光试验(IFAT)表明,B.microti天然蛋白Bmi TrxR定位于虫体胞浆中。四、重组蛋白Bmi TrxR进行了酶活性分析,发现对于底物DTNB具有显著的NADPH依赖的二硫化物还原酶活性。应用抑制药物金诺芬的浓度为12.5μM时,酶活性几乎完全被抑制。本研究克隆了田鼠巴贝斯虫Bmi TrxR的全长cDNA,完成编码基因的重组表达和纯化,进行了该分子的免疫学鉴定,并验证了重组表达蛋白的二硫化物还原酶活性。研究结果为巴贝斯虫硫氧还蛋白抗氧化体系分子机制的研究提供了基础,也为发现抗虫药物靶标提供线索。