CD4+T细胞是适应性免疫应答系统的主要组分，在调节抗原特异性免疫应答中发挥重要作用。一旦被活化之后，初始CD4+T细胞（na veCD4+T cell）可分化成具有不同功能的各种T细胞亚群，包括Th1（T helpcell1）, Th2（T help cell2）, Th17（IL-17producing T cell）细胞和调节性T细胞（regulatory T cell, Treg），目前广泛认为Th17和Treg细胞的分化平衡在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）等自身免疫病的发生发展中起更重要的作用。Th17细胞因其可分泌IL-17（interleukin17）而命名，表达特异性转录因子RORC（orphan nuclear receptor C），具有促炎症反应的作用，且与组织特异性自身免疫性疾病的免疫应答相关。Treg细胞表达CD25和FoxP3（foxhead box protein3），具有抑制T细胞增殖、抑制抗原呈递细胞（antigen presenting cell, APC）的功能、抑制促炎性细胞因子及抗体的分泌等作用，在抑制移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡稳态等方面发挥重要功能。抗原提呈过程中，T细胞的分化方向主要决取于三个因素：T细胞抗原受体（T cells receptor, TCR）的刺激强度、细胞因子的种类和APCs所分泌的其他调节介质，如前列腺素（prostaglandin, PGs）。PGs包括PGD2，PGE2，PGF2，PGI2和TXA2，对免疫系统有明确的调节作用，一直以来PGE2被认为是引起RA的首要PG。但目前的研究结果显示，在胶原诱导的关节炎（collagen induced arthritis，CIA）小鼠的疾病进展中，PGI2和PGE2发挥同等重要的作用。已有包括我室在内的一些研究致力于PGE2对Treg和Th17细胞分化的调节作用，结果显示PGE2可通过调节Treg/Th17细胞平衡参与RA发病。但是，关于PGI2调节Treg和Th17分化的作用尚不明确。PGI2通过结合G蛋白偶联受体IP发挥其生物学作用，IP受体活化可引起胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）水平升高及下游蛋白激酶A（protein kinaseA, PKA）活化。另外，转录活化子5（signal transducers and transcription activators5, STAT5）和转录活化子3（STAT3）分别是调节T细胞向Treg和Th17细胞分化的关键核转录因子。有趣的是，STAT5活化可促进Treg细胞而抑制Th17分化，而STAT3磷酸化可促进RORC而抑制FoxP3表达。而且，cAMP-PKA信号通路的活化有可能导致STAT3和STAT5磷酸化水平的变化。然而，cAMP-PKA信号通路是否参与了PGI2调节Treg和Th17细胞分化的过程，以及PGI2对STAT3和STAT5的活化有无调节作用尚无文献报道。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）和羟氯喹（hydroxychloroquine, HCQ）都是常用的慢作用抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drug,DMARDs），二者单独或联合使用对RA有明显疗效，但其作用机制尚未完全阐明。研究结果表明MTX和HCQ治疗RA的机制都有可能与Treg细胞有关，而Treg和Th17细胞在分化上相互抑制。如果PGI2确实可以影响Treg和Th17细胞分化，比如说导致二者分化失衡，那么MTX和HCQ对PGI2的作用结果会有什么影响呢？基于上述理论和研究结果，我们认为炎性介质PGI2可能对Treg/Th17分化具有调控作用，进而参与RA的发病和进展，cAMP-PKA信号通路,STAT3和STAT5分子可能参与了该调节过程，而MTX和HCQ可能通过影响PGI2对Treg/Th17分化的调节作用而治疗RA。据此，本课题使用磁珠分选健康人外周血来源的na ve CD4+T细胞，分别体外诱导其向Treg和Th17细胞分化，检测PGI2类似物对Treg和Th17细胞分化的调节作用，并探索cAMP-PKA信号通路, STAT3和STAT5分子在其调节过程中的作用，同时观察MTX和HCQ对PGI2所致的上述调节作用及相关信号转导通路的影响，以进一步探索PGI2在RA发病中的免疫调节机制及MTX和HCQ的治疗机制。1PGI2类似物对Th0向Treg和Th17细胞分化的调节作用目的：Treg和Th17细胞的分化平衡在RA等自身免疫病的发生发展中起重要作用，PGE2可通过调节Treg/Th17细胞平衡参与RA发病。在CIA小鼠的疾病进展中，PGI2和PGE2作用相似。故本部分研究使用磁珠分选健康人外周血来源的na ve CD4+T细胞，体外分别诱导其向Treg和Th17细胞分化，检测PGI2类似物对Th0细胞向Treg和Th17细胞分化的调节作用。方法：免疫磁珠法分选健康人外周血来源的CD4+CD45RA+T细胞，流式细胞术鉴定纯度。（1）首先检测PGI2受体IP的表达：使用RT-PCR、流式细胞术和荧光免疫共聚焦技术检测na ve CD4+T表面是否有IP受体的表达。（2）Treg和Th17细胞诱导成功的鉴定：收集分选后的细胞，接种于anti-CD3预先包被的24孔板，加入anti-CD28、TGF-β1和IL-2诱导Th0向Treg分化；或加入anti-CD28、TGF-β1、IL-6、IL-1β和IL-23诱导Th0向Th17分化，诱导培养7天。分别于0d、1d、3d、5d和7d收集细胞，RT-PCR检测FoxP3或RORC mRNA的相对表达；在7d收集细胞，用流式细胞术测定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T的细胞数量，并用ELISA方法测定Th17细胞上清中IL-17A含量。（3）PGI2类似物（伊洛前列素，Iloprost）对Th0向Treg和Th17细胞分化的调节作用及其受体学机制：将收集的细胞各分为六组：Control组（单纯诱导组）；Iloprost（0.1μM、1μM、10μM）组；IP拮抗剂组（CAY10449）；CAY10449+Iloprost（10μM）组，按照上述诱导方案分别培养7天，收集细胞，用RT-PCR检测FoxP3或RORC mRNA的表达；流式细胞术测定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T的细胞数量；用ELISA方法测定Th17细胞上清中IL-17A含量。结果：（1）RT-PCR结果显示，人外周血来源的na ve CD4+T表达一定水平的IP mRNA，流式细胞术和免疫共聚焦的结果进一步证实了IP蛋白的表达。（2）诱导培养7d后，使得（30.83±5.77）%细胞同时表达CD25和FoxP3，CD4+IL-17+T细胞比例达到（5.39±0.88）%。RT-PCR结果显示，FoxP3或RORC mRNA的表达均具时间依从性，且均在7d达到高峰，说明成功诱导了Treg和Th17细胞的分化。（3）Iloprost能剂量依赖性抑制FoxP3mRNA的表达和CD25+FoxP3+T细胞增殖（P<0.05）；同时，Iloprost可剂量依赖性增加RORC mRNA的表达水平和CD4+IL-17+T细胞的数量（P<0.05），另外，Iloprost也促进了IL-17A的分泌（P<0.05）。（4）使用CAY10449拮抗IP受体之后，Iloprost的上述作用在很大程度上被阻断。以上结果提示，PGI2类似物通过与na ve CD4+T细胞表面的IP受体结合而抑制Treg细胞分化，同时促进Th17细胞分化。我室之前的研究结果发现，PGE2可通过调节Treg/Th17细胞平衡参与RA发病。综合分析这些实验结果，提示前列腺素通过调节Treg和Th17分化而导致Treg/Th17分化失衡，在诸如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发病中发挥重要作用。2MTX和HCQ对PGI2类似物调节Treg/Th17细胞分化的影响目的： MTX和HCQ都是常用的DMARDs，二者单独或联合使用对RA有明显疗效，但其作用机制尚未完全阐明，研究表明MTX和HCQ的治疗机制可能与Treg细胞有关。本部分研究体外诱导Th0向分别向Treg和Th17细胞分化，观察单独和联合应用MTX和HCQ对Treg和Th17细胞分化的调节作用，及其对Iloprost所引起的Treg/Th17分化失衡产生的影响，以期进一步揭示MTX和HCQ的免疫调节机制。方法：CD4+CD45RA+T细胞的分选同第一部分。（1）MTX和HCQ单独及联合作用对Treg和Th17细胞分化的影响：将收集的细胞各分为八组：Control组（单纯诱导组）；MTX（1nM、10nM、100nM）组；HCQ（1nM、10nM、100nM）组；MTX（100nM）+HCQ（100nM）组，按照上述Treg和Th17细胞诱导方案分别培养7天，收集细胞，用RT-PCR检测FoxP3或RORC mRNA的表达；流式细胞术测定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T的细胞数量；用ELISA方法测定Th17分化细胞上清中IL-17A含量。（2）MTX和HCQ单独及联合作用对Iloprost所引起的Treg/Th17分化失衡产生的影响：将收集的细胞各分为七组：Control组（单纯诱导组）；Iloprost（10μM）组；MTX（100nM）组；HCQ（100nM）组；Iloprost+MTX组；Iloprost+HCQ组；Iloprost+MTX+HCQ组，按照上述Treg和Th17细胞诱导方案分别培养7天，收集细胞，用RT-PCR检测FoxP3或RORC mRNA的表达；流式细胞术测定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T的细胞数量；用ELISA方法测定Th17分化细胞上清中IL-17A含量。结果：（1）单独HCQ和MTX+HCQ联合作用均能增加FoxP3mRNA的表达和CD25+FoxP3+T细胞的数量（P<0.05），且降低RORC mRNA的表达水平和CD4+IL-17+T细胞的数量（P<0.05），HCQ的上述作用具剂量依赖性。另外，单独HCQ和MTX+HCQ联合作用均抑制了IL-17A的分泌（P<0.05）。而单独MTX对上述指标均无明显影响（P>0.05）。单独HCQ和MTX+HCQ联合的作用效应相比基本无显著差异（P>0.05）。（2）MTX和HCQ单独及联合作用均可上调Iloprost所抑制的FoxP3mRNA的表达和CD25+FoxP3+T细胞的数量（P<0.05），且下调Iloprost所促进的RORCmRNA的表达和CD4+IL-17+T细胞的数量及IL-17A的分泌（P<0.05）。相对而言，二者的联合作用强于单独作用。以上结果表明，MTX和HCQ单独及联合作用均可不同程度地上调被PGI2类似物抑制的Treg细胞分化，而下调被PGI2类似物促进的Th17细胞分化，二者的联合作用强于单独作用，推测MTX和HCQ可能通过纠正PGs所致的Treg/Th17失衡而发挥治疗RA等自身免疫病的作用。3PGI2类似物调节Treg/Th17细胞分化的信号转导机制及MTX和HCQ对该通路的影响目的：PGI2通过结合G蛋白偶联受体IP发挥其生物学作用，IP受体活化可引起胞内cAMP水平升高及下游PKA活化。STAT3和STAT5分别是调节Th0细胞向Treg和Th17分化的关键核转录因子。然而，cAMP-PKA信号通路的活化有可能导致STAT3和STAT5磷酸化水平的变化。本部分研究探索Iloprost对T细胞分化的调节过程中，cAMP-PKA信号通路、STAT3和STAT5分子所发挥的作用，以及MTX及HCQ对Iloprost所活化的信号转导通路的影响，以进一步探索PGI2在RA发病中的免疫调节机制及MTX和HCQ的治疗机制。方法：CD4+CD45RA+T细胞的分选同第一部分。（1）收集分选的细胞，分别按照Treg和Th17细胞诱导方案培养7天，将诱导成功的Treg和Th17细胞分别分为七组： Control组（单纯诱导组）； Iloprost组；CAY10449+Iloprost组； Iloprost+MTX组； Iloprost+HCQ组；Iloprost+MTX+HCQ组；db-cAMP组，用免疫荧光法测定胞内cAMP含量。（2）cAMP-PKA信号通路在Iloprost调节Treg和Th17细胞分化中的作用：将分选后收集的细胞各分为四组：Control组（单纯诱导组）；Iloprost组；db-cAMP组；H-89+Iloprost组，按照上述Treg和Th17细胞诱导方案分别培养7天，收集细胞，用RT-PCR检测FoxP3或RORC mRNA的表达；流式细胞术测定CD25+FoxP3+T或CD4+IL-17+T细胞数量；用ELISA方法测定Th17分化细胞上清中IL-17A含量。（3）收集分选的细胞，加入anti-CD3和anti-CD28抗体，将细胞分别分为八组： Control组； Iloprost组；CAY10449+Iloprost组； Iloprost+MTX组； Iloprost+HCQ组；Iloprost+MTX+HCQ组；db-cAMP组；H-89+Iloprost组，于37℃、5%CO2培养箱培养20h，然后加入3μl IL-2或IL-6，37℃孵育30min，用Phowsflow技术分别检测各组细胞中STAT5或STAT3的磷酸化水平。结果：（1）Iloprost可分别使得诱导培养7天的Treg和Th17细胞内的cAMP水平增加近4倍和6倍多（P<0.05），作为阳性对照的db-cAMP也产生了类似的结果，而IP拮抗剂却可以非常有效地阻断Iloprost对cAMP含量产生的影响。MTX和HCQ单独及联合作用均不同程度地降低了Iloprost所上调的Treg和Th17胞内cAMP水平（P<0.05），其中MTX+HCQ组和单独HCQ组的抑制作用较强。（2）db-cAMP模拟了Iloprost降低CD25+FoxP3+T细胞数量和FoxP3mRNA水平，及增加CD4+IL-17+T细胞数量和RORC转录水平以及IL-17A分泌的作用（P<0.05），而采用特异的PKA抑制剂H-89阻断cAMP-PKA信号通路，可大大削弱Iloprost对Treg和Th17细胞分化的调节作用。（3）Iloprost促进了IL-6所致的STAT3磷酸化，但抑制了IL-2所致的STAT5磷酸化，CAY10449可以明显削弱Iloprost的上述作用效应。MTX和HCQ单独及联合作用均不同程度地增加了Iloprost所下调的STAT5磷酸化水平，且降低Iloprost所上调的STAT3磷酸化水平（P<0.05）。（4）db-cAMP模拟了Iloprost抑制IL-2所致的STAT5磷酸化，及促进IL-6所致的STAT3磷酸化的作用。而用H-89阻断cAMP-PKA之后再加入Iloprost，p-STAT5水平明显增加，p-STAT3水平明显降低，与Iloprost组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。以上结果表明，PGI2-IP可能通过上调cAMP-PKA信号通路，从而上调p-STAT3而下调p-STAT5表达，进而促进Th17细胞而抑制Treg细胞分化。而MTX和HCQ单独及联合作用均可显著削弱PGI2-IP在上述信号通路中的调节作用，推测MTX和HCQ可能通过拮抗PGs与其受体结合后引发的cAMP-PKA-STAT3/STAT5信号通路，而纠正PGs所致的Treg/Th17失衡，从而发挥治疗RA等自身免疫病的作用。结论本研究使用磁珠分选健康人外周血来源的na ve CD4+T细胞，体外分别诱导其向Treg和Th17细胞分化，检测PGI2类似物对Treg和Th17细胞分化的调节作用，并且探索cAMP-PKA信号通路, STAT3和STAT5分子在其调节过程中的作用，同时观察MTX和HCQ对PGI2所致的上述调节作用及相关信号转导通路的影响，得出以下结论：1本实验首次在细胞水平证实PGI2类似物抑制Treg细胞体外分化，同时促进Th17细胞分化，二者的共同作用可诱导外周血T细胞亚群的紊乱，进而促进T细胞介导的自身免疫性疾病的发生发展。2PGI2类似物上述作用主要由IP受体介导，可能通过其上调cAMP-PKA信号通路，从而上调STAT3磷酸化而下调STAT5的磷酸化所致。3MTX和/或HCQ均可削弱PGI2类似物对上述信号通路的调节作用，进而逆转PGI2类似物对Treg和Th17细胞分化的影响，也就是说MTX和HCQ可能通过纠正Treg/Th17分化失衡而发挥治疗RA等自身免疫性疾病的作用。总之，PGI2-IP通过抑制Treg细胞分化和促进Th17细胞分化在RA等自身免疫性疾病的发病中发挥重要的促炎作用。MTX和HCQ可通过多靶点发挥治疗作用，其中主要的途径之一是通过纠正PGs所致的Treg/Th17分化失衡而抑制T细胞介导的自身免疫反应和炎症反应。本研究为进一步完善PGs在自身免疫性疾病中的免疫调节作用及MTX和HCQ的治疗机制提供了重要的理论依据。