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结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的单一病原菌造成人类死亡的重大疾病，据WHO2015年最新统计结果显示，全球新增感染结核病人高达1040万人，其中，合并艾滋病毒（HIV）感染人数达到120万人，中国、印度等发展中国家占新增病例的60％，仅2015年一年死于结核病的人数为140万，其中40万人死于结核病合并HIV感染，近十几年来，由于艾滋病感染以及免疫抑制剂广泛使用，使得MTB耐药率增加。因此，寻求一种有效预防MTB传播的新型疫苗万分迫切。 肝素结合血凝素（heparin-binding haemagglutinin,HBHA）是结核分枝杆菌重要的粘附蛋白，然而，关于HBHA在结核分枝杆菌中的毒力作用目前尚不明确。鉴于自噬在病原菌感染过程中发挥着十分重要的作用，本课题组利用Western blot、免疫荧光、siRNA和同源重组敲减BCG菌株中HBHA蛋白等技术，检测HBHA是否能够调控巨噬细胞自噬， HBHA调控巨噬细胞自噬过程中通过什么分子机制来辅助MTB逃离免疫杀伤，是本课题的重点研究内容。 主要研究内容分为以下三个部分： 第一部分、HBHA抑制巨噬细胞自噬 HBHA（8μg/mL）与巨噬细胞共同孵育2 hours，Western blot检测LC3Ⅱ、Beclin-1、mTOR的表达水平，结果显示，HBHA能够显著抑制自噬标志物LC3Ⅱ、Beclin-1的表达，促进mTOR表达；为了更直观的观测LC3变化情况，我们还运用免疫荧光检测LC3，免疫荧光结果显示LC3荧光颗粒显著降低，表明HBHA能够抑制LC3的生成；通过siRNA技术敲减Raw264.7细胞中NOD2和TLR4的表达水平，Western blot检测LC3、P62变化情况，结果证明TLR4 siRNA组的细胞能够有效阻断HBHA抑制自噬这一过程，表明HBHA是通过调控TLR4的表达从而抑制巨噬细胞自噬；通过同源重组方法构建BCG::HBHA敲除株和BCG野生株感染Raw264.7巨噬细胞，免疫荧光观察LC3变化情况，结果显示，BCG::HBHA敲除株不能有效抑制LC3表达。 第二部分、HBHA通过活化Caspase家族诱导巨噬细胞凋亡 流式细胞术Annexin V-FITC/PI检测细胞总凋亡率，流式细胞检测结果显示，HBHA（10μg/mL）作用巨噬细胞24 hours/48 hours细胞总凋亡率显著升高，为了验证是HBHA纯化蛋白促进的细胞凋亡，而不是因为细胞培养时间过长，培养液营养不足造成的细胞凋亡，我们运用免疫荧光检测HBHA纯化蛋白何时进入巨噬细胞，并且，能够在细胞中存在多长时间不降解，结果显示，HBHA（4μg/mL）2 hours就有少量进入巨噬细胞，随着时间延长，蛋白进入细胞增多，并能稳定表达至72 hours；Western blot检测Caspase-8/Caspase-3活化程度，在HBHA作用24/48 hours均有活化的Caspase-3/Caspase-8条带出现，加入Caspase家族的抑制剂z-VAD-fmk后，未见活化Caspase-3/Caspase-8条带，表明HBHA是通过活化Caspase家族促进巨噬细胞凋亡；Western blot检测凋亡抑制基因bcl-2的表达，HBHA作用24 hours后能够显著抑制bcl-2的表达。 第三部分、HBHA诱导巨噬细胞M2极化 1. HBHA纯化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬细胞72 hours，通过ELISA的方法对细胞上清细胞因子进行检测，结果显示，IL-10的表达水平升高，而TNF-α表达水平降低，初步推断HBHA在低浓度、长时间诱导巨噬细胞，能够将Raw264.7巨噬细胞诱导成M2型巨噬细胞；HBHA纯化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬细胞72 hours，分别通过Western blot、免疫荧光、流式细胞技术检测ARG-1、CD206、iNOS表达水平，结果显示，ARG-1和CD206表达均升高，表明巨噬细胞成功诱导成M2型，加入HBHA（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬细胞72 hours，结果显示，ARG-1和CD206表达升高，证明HBHA低浓度长时间可将巨噬细胞诱导成M2型巨噬细胞；HBHA纯化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬细胞72 hours检测CUEDC2表达水平，并与未处理组巨噬细胞相比，HBHA（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬细胞72 hours能够促进CUEDC2表达。 综上结果所示，HBHA在调节巨噬细胞功能方面起到了重要作用。