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目的:急性酒精中毒,是指一次摄入过量的乙醇,使得乙醇的吸收大于代谢。据世界卫生组织,全球每年由于饮酒所致死亡(包括酒精中毒死亡和酒驾车祸死亡)人数己达250万,这对个人、家庭和社会都造成了严重影响。因此,寻求有效的解酒药物有着巨大且重要的现实意义。醒脑静注射液(Xingnaojing Injection,XNJI)是源于吴鞠通的《温病条辨》中的经典名方安宫牛黄丸,主要由麝香、冰片、郁金和栀子四味中药组成,具有疗效确切、应用广泛的特点,临床上常用于治疗各种昏迷证,如酒精昏迷等。酒精主要由肝脏代谢,其中在代谢过程中产生的乙醛和活性氧簇可诱发氧化应激反应,引起肝脏损伤;酒精对中枢神经系统有抑制作用,被吸收入血的乙醇可通过血脑屏障进入大脑,引起机体功能紊乱,造成记忆认知、运动协调等多种功能障碍。本研究通过腹腔注射34%乙醇建立急性酒精昏迷动物模型,给予三种不同剂量的XNJI处理,观察大鼠肝脏乙醇代谢酶活力、氧化应激反应和病理改变;另外,通过微透析实验,观察腺苷(Adenosine,AD)和觉醒肽(Orexin A)这对抑制-兴奋性神经递质的动态变化,以及两者相关的受体和蛋白的mRNA表达量。本文采用微透析、分子生物学等技术研究XNJI对酒精性昏迷的促醒和神经作用机制,为研发更有效的解酒促醒药物奠定基础。方法:1 XNJI对酒精性昏迷大鼠肝脏乙醇代谢酶和氧化应激的影响本实验采用34%乙醇建立急性酒精昏迷大鼠模型,研究XNJI对酒精性昏迷大鼠翻正反射消失(Loss of the righting reflex,LORR)维持时间的影响;采用试剂盒测定大鼠肝脏中乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)、乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性以及还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察大鼠肝脏的病理学改变,以探讨XNJI对酒精性昏迷大鼠肝脏乙醇代谢酶和氧化应激的影响。2高效液相色谱法测定人工脑脊液中腺苷含量的条件优化本实验采用高效液相色谱法(High-performance liquid chromatography,HPLC)测定AD在不同检测波长和不同流动相比例中的峰面积和保留时间,对AD的HPLC色谱条件进行优化使其有最大的吸收,为人工脑脊液中AD的测定提供可靠的检测方法。3醒脑静注射液对酒精性昏迷大鼠的促醒神经机制研究本实验采用微透析技术采集大鼠的脑脊液,HPLC联合紫外检测器测定脑脊液中AD的含量,酶联免疫吸附试剂盒(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定脑脊液中orexin A的含量;荧光定量PCR技术测定大鼠下丘脑区 OX1R、A1R、ENT1、ADK的mRNA表达量,探讨XNJI对酒精性昏迷大鼠下丘脑脑脊液中AD、orexin A的动态变化,以及OXiR、A1R、ENT1、ADK mRNA表达量的影响。结果:1 XNJI对酒精性昏迷大鼠肝脏乙醇代谢酶的影响与空白对照组相比,模型对照组肝脏中ADH和ALDH活性均有显著性下降(P<0.01)。醒脑静注射液中剂量组的LORR(2.92±0.24 h)比低剂量组(3.92±0.68 h)和高剂量组(3.59±1.16h)都短,而且与模型对照组(4.26±0.56h)相比有统计学意义(P<0.01),其他各组与模型对照组相比均无统计学意义(P>0.05);醒脑静中、高剂量组对大鼠肝脏中ADH和ALDH活性均有不同程度的提升(P<0.01),醒脑静低剂量组对ADH、ALDH活性无影响(P>0.05);2 XNJI对酒精性昏迷大鼠肝脏氧化应激反应的影响与空白对照组相比,模型对照组肝脏中的SOD活性显著下降(P<0.01),MDA含量则明显升高(P<0.01),而GSH含量无显著变化(P>0.05)。与模型对照组相比,醒脑静低剂量组SOD活性显著地提高(P<0.01),MDA含量有效地降低(P<0.01),对GSH含量无明显提高(P>0.05);醒脑静中剂量组对SOD活性和GSH含量均有不同程度的提升(P<0.01),同时明显地降低MDA含量(P<0.01)。醒脑静高剂量组有效提高GSH含量(P<0.01),但SOD活性无明显变化(P>0.05)。醒脑静注射液能改善肝组织细胞病变,减轻肝细胞水肿,维持正常的肝细胞形态。3 HPLC测定AD的色谱条件优化AD在250-260 nm波长中的保留时间均约为5.9min,而AD的峰面积则随着波长的增加而增加;甲醇和8 mmol/LNaH2PO4的比例对AD的峰面积影响不大,但对其保留时间有着明显的作用,随着甲醇比例的增加,AD的出峰时间随之缩短。AD的HPLC最佳色谱条件为流动相A:流动相B=20%甲醇:8 mmol/LNaH2PO4,检测波长:260nm。4 XNJI对酒精性昏迷大鼠脑脊液中AD、orexin A水平的影响与空白对照组相比,模型对照组中腺苷水平在135min到270min显著高于空白对照组(P<0.01)。与模型对照组相比,醒脑静注射液低、高剂量组中腺苷水平均有下降的趋势,但是无统计学意义(P>0.05);醒脑静注射液中剂量组腺苷水平在Omin到270min内均小于模型对照组,其中135min到270min内腺苷水平明显低于模型对照组(P<0.05)。与空白对照组相比,模型对照组给予34%乙醇造模后,orexinA水平并无明显变化(P>0.05)。与模型对照组相比,醒脑静注射液低、中、高剂量组在组间比较中均未见显著变化(P>0.05)。5 XNJI对酒精性昏迷大鼠外侧下丘脑OX1R、A1R、ENT1、ADK mRNA表达量的影响与空白对照组相比,模型对照组的OX1R、A1R、ENT1 mRNA的表达均呈现显著下降(P<0.05),而ADK无明显差异。与模型对照组相比,醒脑静注射液低、中、高剂量组均能显著上调OX1R的表达(P<0.05),而有效地下调AiR表达(P<0.05)。对于ENT1,醒脑静注射液中剂量组可显著降低其表达(P<0.05),但低、高剂量组均未见明显改变(P>0.05);而对于ADK,醒脑静注射液高剂量组可显著上调其表达(P<0.01),但中、高剂量组均未见明显改变(P>0.05)。结论:醒脑静注射液对酒精性昏迷大鼠模型具有促醒作用,其机制可能与其抗氧化应激以及兴奋性神经递质觉醒肽和抑制性神经递质腺苷及其相关受体OX1R、A1R及蛋白ENT1、ADK mRNA的表达的调控有关。