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抗冻蛋白(antifreezeproteins,AFPs)是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质,能在结冰或亚结冰条件下保护生物体不受伤害。从胡萝卜中分离并克隆了抗冻蛋白(DcAFP)基因及其启动子pafp。前期的实验表明,在双子叶植物烟草中,pafp是一个组成型表达的强启动子,其平均表达活性比35S高约4倍,有作为构建植物表达载体的启动子的潜力。为了进一步探讨掘其应用价值,本研究将连接有pafp的载体pC1381-pafp转入单子叶植物水稻中,检测pafp的启动子活性。GUS定量分析结果显示pafp在单子叶植物水稻中的活性是Actin的1/3,35S的44.63倍,同样是一个较强活性的启动子,此外,通过将pafp反方向连接报告基因Gus,构建了pC1381-pafp载体,并转化烟草,GUS定性分析结果表明反向pafp也具有启动子活性,以上结果显示pafp对植物表达载体的构建具有较高的应用价值。可以考虑将其应用于植物表达载体的构建。
由于胡萝卜中抗冻蛋白(DcAFP)的表达是冷诱导性的,但我们分离的启动子元件pafp并无冷诱导性。因此推测pafp上游可能存在冷诱导相关元件,于是本研究设计染色体步移实验得到一段上游序列,并做了初步分析,后续实验可以通过连到pafp上游检测有无冷诱导性,寻找相关的冷诱导元件。
本实验室前期的研究表明,转入DcAFP基因的烟草与野生型烟草相比,抗冷性有了很大的提高。为了使热带观赏植物绿巨人适应我国北方寒冷的气候,将胡萝卜抗冻蛋白(DcAFP)基因转入绿巨人中,得到经潮霉素筛选的转基因植株小苗,经过炼苗移入盆中栽培,与同时移入盆中的野生型绿巨人相比,叶片颜色更深,生长较为缓慢。通过抗冷实验表明,在10℃和4℃的低温条件下,转基因绿巨人的抗冷性较野生型植株都有了明显的提高。这对于将热带植物引入温带甚至寒带有一定的实际意义和应用价值。