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抗菌肽(antibacterial peptides, ABP)又称抗微生物肽(antimicrobial peptides, AMP)或肽抗生素(peptide antibiotics),是生物机体为对抗外源性病原体及恶性细胞,由免疫防御系统非专一性应答产生的一类小分子活性肽类的总称。抗菌肽通常是由10-50个氨基酸组成的小分子多肽,具有抗菌谱广、热稳定性强、分子量小及免疫原性小等特点,其杀菌机制独特,不易产生耐药菌,有望开发为新一代肽类抗生素。两栖类动物的生活环境复杂多样,而且皮肤湿润、裸露,与各种微生物密切接触,为外界微生物的入侵创造了便利条件。它们依靠皮肤腺体分泌出一系列抗菌肽,防御外界病原菌的侵袭。蛙科(Ranidae)是无尾目的第三大科,其分布几乎遍及各大洲,其皮肤抗菌肽的种类和数量极其惊人,这意味着对其进行研究有着巨大的价值。在本实验室前期工作中,获得了一系列黑龙江林蛙皮肤抗菌肽的cDNA序列,将其中的一条命名为dybowskin-2CAMa。该肽是一新型肽,不同于已报道的蛙类抗菌肽,除序列特异性外,还具有正电荷多、等电点高、亲水性强等特点。其结构预测分析以及氨基酸分布显示,dybowskin-2CAMa为一类对细菌膜有高亲和性的阳离子α-螺旋抗菌肽,推测其可能具有较强的抗菌活性。为进一步了解新型肽D-2CDYb的生物学特性,本实验根据抗菌肽dybowskin-2CAMa的基因序列,考虑毕赤酵母偏好性,成熟肽A+T的含量及成熟肽N末端与信号肽序列的一致性等因素设计四条引物,利用SOE-PCR方法获得dybowskin-2CAMa全长基因,连接到酵母分泌型表达载体pPICZαA,构建了pPICZαA-dybowskin-2CAMa毕赤酵母重组表达质粒,重组质粒经SacI酶切线性化后,电转化巴斯德毕赤酵母X33,构建真核表达体系,筛选出了抗Zecoin 2000μg/mL的转化子,然后用PCR方法鉴定重组菌株。阳性转化子经甲醇诱导表达后,提取酵母细胞总基因组,利用α-factor引物、3’AOX引物其进行扩增,获得300bp左右的扩增产物,与目的基因dybowskin-2CAMa大小吻合,说明目的基因已插入宿主染色体中。提取经诱导表达后的酵母细胞总RNA后,通过RT-PCR的方法验证,结果说明抗菌肽dybowskin-2CAMa的基因已转录。有活性的发酵液上清通过YMC﹡GEL ODS-A和SephadexTM G-25 Fine凝胶柱层析获得dybowskin-2CAMa纯品,纯品经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDE-TOF-MS)分析,分子量与dybowskin-2CAMa分子量一致,通过抑菌试验和溶血试验,显示重组抗菌肽dybowskin-2CAMa对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制活性,且对革兰氏阳性细菌的抑制作用比对革兰氏阴性细菌的抑制作用强,对耐药株大肠杆菌EBSL的最小抑菌浓度为4μg/mL,并且在浓度为500μg/mL时,没有溶血现象。本文研究结论:利用巴斯德毕赤酵母表达体系能够正确表达黑龙江林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-2CAMa基因。重组抗菌肽dybowskin-2CAMa对革兰氏阴性菌(大肠杆菌),革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抑制活性,且对革兰氏阳性细菌的抑制作用比对革兰氏阴性细菌的抑制作用强,对耐药株大肠杆菌EBSL的最小抑菌浓度为4μg/mL,并且在浓度为500μg/mL时,没有溶血现象。本研究为进一步研究抗菌肽dybowskin-2CAMa的杀菌及抑瘤的作用机理提供了稳定的样品来源。