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G4 DNA(G-quadruplex)是一类由富含连续鸟嘌呤的DNA序列形成的四链螺旋结构,其通过同一平面上的四个鸟嘌呤之间形成氢键配对来维持结构稳定。生物信息学分析表明G4 DNA序列大量分布在各个生物体的基因组中,特别是与基因与基因组代谢密切的区域,例如端粒末端、DNA复制起始区、基因转录调控区和癌基因启动子等区域。最近通过高分辨测序技术已经确定人类基因组中至少存在716,310个G4序列,同时使用能够与G4特异结合的抗体与药物小分子识别也进一步证实了G4高级结构在活体细胞中的真实存在。因此,G4结构将会对DNA复制、DNA修复、基因转录与翻译、端粒代谢等多种生命代谢产生重要的影响。目前有部分研究表明,负责高等生物基因组复制的DNA聚合酶将会被G4结构阻碍,从而发生复制叉停滞现象。与此同时,在高等生物中还发现了一些能够特异识别并复制G4结构的损伤修复合成(TLS)DNA聚合酶,包括人类聚合酶Rev1、聚合酶η和聚合酶κ。尽管高等生物中G4复制的研究已有部分进展,但是在原核生物中G4及其中间体的数量、原核聚合酶在复制过程中遭遇G4之后的反应现象以及原核生物体中G4的复制机制等问题,都还没有任何的研究与报道。目前大肠杆菌包含5种DNA聚合酶(Pol),分别是Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV和Pol VI,其中DNA聚合酶I(Pol I)在大肠杆菌中最为丰富(每个细胞约含有400个Pol I)。与此同时,Pol I广泛参与后滞链上冈崎片段的成熟、DNA的修复、DNA的同源重组以及一些损伤修复合成过程,而在这些DNA代谢过程中,含有G4序列的DNA单链极易形成某种G4结构,因此Pol I必定会遭遇G4结构。因此,本课题结合单分子FRET技术(smFRET)、stop-flow技术和DNA聚合酶阻滞技术等实验手段,系统地探究了大肠杆菌DNA聚合酶I在不同的条件下对G4结构的复制过程及其复制机理。并取得了以下结论:(1)通过生物信息学分析可以确定,大肠杆菌基因组中的确存在G4及其中间体序列,并且有两类G4模体非常保守。此外本研究还使用已有的高通量测序数据分析了G4对高通量测序读取覆盖度(reads coverage)的影响,结果表明G4序列将会显著影响测序读取覆盖度,因此其可能对DNA复制产生重要的影响。(2)通过smFRET技术研究了低浓度的聚合酶对G4的复制过程。结果发现,DNA聚合酶I对G4的复制受到G4结构稳定性的影响。当G4结构稳定性较低的时候,DNA聚合酶I能够完全或者部分复制G4结构,当G4结构稳定性较高的时候,DNA聚合酶I将完全被G4结构阻碍。(3)通过DNA聚合酶阻滞实验发现生理浓度下的DNA聚合酶I能够顺利完成常规的稳定的G4结构的复制,但是对于某些极其稳定的G4结构,例如CEB-G4和4G4,高浓度的DNA聚合酶I仍然完全被阻碍。(4)使用stop-flow实验确定了DNA聚合酶I对G4结构的复制机制:DNA聚合酶I必须依赖于dNTPs的水解释放的能量来破坏G4结构,并且可能需要DNA聚合酶I的多聚化实现G4结构的完全复制。而这和高等生物聚合酶Rev1对G4的复制机制完全不同。与此同时,大肠杆菌中还存在一种能够特异地识别并解旋G4结构的DNA解旋酶RecQ。作为RecQ家族解旋酶的结构与功能原型,RecQ在大肠杆菌的DNA损伤修复与基因同源重组等细胞代谢过程中发挥着至关重要的作用。因此,本研究使用smFRET技术系统地探测了RecQ解旋酶对双链DNA以及G4 DNA的结合与解旋过程,与此同时确定了HRDC结构域对RecQ催化核心的活性影响。并取得了以下结论:(1)RecQ对DNA的结合能力非常强,但是HRDC结构域对DNA的结合能力有显著的促进作用。进一步研究发现这种促进过程可能依赖于HRDC结构域对RecA的构象的改变,从而增强了RecQ催化核心对DNA的结合能力。(2)RecQ在双链DNA的解旋之前将会出现显著的等待过程,这个过程受到HRDC结构域的调节。当HRDC结构域存在的时候,解旋等待时间将会极大增长,说明HRDC结构域在一定程度上抑制了解旋起始。同时RecQ解旋DNA的过程中将会出现链转换现象,这种链转换过程同样受到HRDC结构域的抑制。(3)RecQ具有单链DNA拉拽活性(reeling process)。当HRDC结构域不存在时,reeling过程非常频繁,HRDC结构域存在时,reeling过程非常稀少,因此HRDC结构域对DNA reeling过程同样有抑制作用。(4)RecQ能够解旋G4结构,并且必须依赖于ATP的水解,但是G4结构对于RecQ而言仍然是一种障碍。当HRDC结构域存在的时候,RecQ催化核心对G4结构的破坏程度更彻底以及其对G4的单次解旋的时间更长,因此HRDC结构域能够显著增强RecQ解旋G4的能力。综上所述,本研究结合了smFRET技术、DNA聚合酶阻滞分析和stop-flow技术等研究方法对大肠杆菌DNA聚合酶I复制G4的过程进行了系统的研究,并确定了G4的复制机制。与此同时,这些方法也可以广泛地运用于其他的聚合酶对G4或其他DNA结构的复制研究,以便于发现DNA复制的分子机制。同时,本研究使用smFRET技术实时探测了大肠杆菌RecQ解旋酶对DNA的结合、双链DNA的解旋、G4 DNA的解旋等一系列DNA代谢过程,明确了RecQ对双链DNA与G4 DNA的解旋机制。与此同时,本研究证实了HRDC结构域在RecQ对DNA代谢过程中的影响及其作用机制。