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目的：
mTOR通路相关基因VHL、PTEN、TSC1、TSC2、FLCN和mTORC1等基因突变与肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的发生和发展相关。mTOR抑制剂依维莫司和替西罗莫司已被FDA批准用于治疗预后不良的肾细胞癌二线药物，但其疗效相对有限，患者往往发展成对mTOR靶向治疗的抵抗。TFEB是近期发现的mTOR的一个重要底物，可被mTOR磷酸化142和211位丝氨酸而失活。TFEB在调控肿瘤发展、自噬、溶酶体生物合成以及细胞代谢中起重要作用。PD-L1是抑制CD8+T细胞肿瘤杀伤功能的重要共抑制配体，是肿瘤细胞免疫逃逸的一种重要机制。本论文探讨肾癌细胞对mTOR靶向抑制剂的抵抗机制，主要集中在研究转录因子TFEB和PD-L1在介导mTOR靶向抑制剂抵抗中的可能功能与机制。
方法：
(1)体外实验评价TFEB对肾癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响：在野生型肾癌细胞系中下调或过表达TFEB，CCK8和EdU参入实验检测肾癌细胞的增殖，流式检测AnnexinV-PI比较肾癌细胞的凋亡，Transwell检测肾癌细胞的迁移能力。
(2)体内模型中进一步研究TFEB在肾癌中的作用：筛选出稳定过表达组成性活化TFEB-S211A的小鼠Renca肾癌细胞系及其对照细胞：①接种BALB/cnude小鼠，构建皮下移植瘤模型，定期用游标卡尺测量瘤体体积；流式检测CD45-肿瘤细胞Ki67和AnnexinV/PI比例，评价在肿瘤细胞过表达TFEB是否影响Renca细胞在小鼠体内的增殖和凋亡。②接种野生型BALB/c小鼠，构建皮下移植瘤模型，定期用游标卡尺测量瘤体体积；组化检测肿瘤组织内瘤细胞TFEB和PD-L1蛋白表达水平；流式检测瘤内杀伤性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)功能因子CD107A、GZMB、IL-2、TNF-α和IFN-γ表达水平，以及NK细胞、TAMs和MDSCs的比例，比较野生型和TFEB-S211ARenca肿瘤内浸润免疫细胞差异。
(3)比较多种人肾透明细胞癌组织中TFEB与PD-L1蛋白水平，探讨肾癌细胞TFEB表达是否与PD-L1表达相关：免疫印迹和流式检测五株人肾癌细胞系TFEB和PD-L1蛋白水平及其相关性；组化比较PD-L1-和PD-L1+区域TFEB的免疫染色评分；分析PD-L1与肿瘤等级、分期之间是否具有相关性。
(4)探究RCC中TFEB对PD-L1的调控机制：在786-O细胞敲低TFEB，或在769-P细胞中过表达TFEB，qPCR和流式分别检测PD-L1mRNA和蛋白水平变化；联用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)和qPCR技术检测TFEB在PD-L1基因启动子上的结合情况；荧光素酶报告试剂盒检测TFEB过表达时PD-L1启动子的转录活性。
(5)体外研究mTOR抑制剂对肾癌细胞系TFEB和PD-L1的作用：肾癌细胞系786-O和769-P用mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1刺激后，免疫印迹和流式分别检测TFEB和PD-L1蛋白表达水平。
(6)阐明mTOR抑制剂上调肾癌细胞PD-L1表达的机制：使用mTOR抑制剂Torin-1刺激肾癌细胞系786-O和769-P细胞，联用染色质免疫共沉淀技术和qPCR技术检测TFEB在PD-L1基因启动子上的结合情况；mTOR抑制剂分别刺激WT和TFEB敲除的786-O细胞系，免疫印迹检测TFEB和PD-L1蛋白水平变化。
(7)探讨mTOR抑制剂对原代肾癌细胞TFEB和PD-L1的作用：从临床肾透明细胞癌组织中分离出原代肾癌细胞，通过免疫荧光实验检测细胞中CAIX阳性率来鉴定原代肾癌细胞的纯度；mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1刺激原代肾癌细胞，分别使用免疫印迹、流式和免疫荧光检测TFEB和PD-L1的变化趋势。
(8)评价mTOR抑制剂和anti-PD-L1联用对肾癌的疗效：皮下接种Renca肾癌细胞构建小鼠移植瘤模型，从接种后12天开始腹腔注射Temsirolimus和anti-PD-L1。游标卡尺测量瘤体体积；组化和流式检测肿瘤细胞Ki-67阳性率；免疫印迹和组化检测肿瘤细胞TFEB和PD-L1表达水平；流式检测瘤内CD8+T细胞CD107A和GZMB表达情况。
结果：
(1)体外实验发现，在786-O细胞中下调TFEB水平，或在769-P细胞中过表达TFEB，均不影响肾癌细胞系的增殖、凋亡和迁移能力。
(2)①在BALB/cnude小鼠中，WT和TFEB-S211ARenca肿瘤体积无显著差别，肿瘤细胞AnnexinV+以及Ki-67+比例无统计学差异；②在野生型BALB/c小鼠中，与WT组相比，接种TFEB-S211ARenca细胞后肿瘤体积明显增大；TFEB-S211ARenca肿瘤中瘤细胞TFEB和PD-L1蛋白水平显著上调。肿瘤浸润CTL中CD107a、GZMB、IL-2和TNF-α比例下调；NK、TAMs和MDSCs的比例无显著差异。
(3)在人肾癌细胞系中，TFEB和PD-L1蛋白水平呈正相关；临床肾透明细胞癌组织PD-L1+区域TFEB的免疫染色评分明显高于PD-L1-区域；PD-L1与肿瘤分级和分期呈正相关。
(4)在786-O细胞中下调TFEB，PD-L1mRNA和蛋白水平显著降低，TFEB在PD-L1基因启动子上的结合减少；反之，在769-P细胞中过表达TFEB，PD-L1mRNA和蛋白水平显著增加，TFEB在PD-L1基因启动子上的结合增多。
(5)mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1处理786-O和769-P细胞后，TFEB和PD-L1蛋白水平显著升高。
(6)用Torin-1刺激786-O和769-P肾癌细胞系，可显著上调TFEB在PD-L1基因启动子上的结合；在786-O细胞中敲低TFEB可显著阻断mTOR抑制剂对PD-L1的上调作用。
(7)mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1可在肿瘤病人原代肾癌细胞中活化TFEB，且呈时间依赖性，并能上调PD-L1蛋白表达。
(8)Temsirolimus和anti-PD-L1联合治疗能协同抑制肾癌肿瘤体积和抑制肿瘤细胞Ki-67+比例；TEM治疗可显著上调肾癌组织中肿瘤细胞的TFEB和PD-L1蛋白水平；联用TEM和anti-PD-L1可增强肿瘤浸润CD8+T细胞CD107a和GZMB的表达。
结论：
在不同的人肾癌细胞系和临床肾癌组织中，TFEB表达与PD-L1表达呈正相关；肿瘤细胞TFEB促进肿瘤生长依赖机体免疫系统；使用mTOR抑制剂能导致TFEB异位入核增多和结合PD-L1基因启动子诱导PD-L1表达，从而抑制CD8+T细胞的杀伤功能，进而介导肾癌细胞免疫逃逸和对mTOR抑制剂的抵抗。mTOR靶向抑制剂和PD-L1抗体联用能在小鼠模型中协同抑制肾癌生长。
mTOR通路相关基因VHL、PTEN、TSC1、TSC2、FLCN和mTORC1等基因突变与肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的发生和发展相关。mTOR抑制剂依维莫司和替西罗莫司已被FDA批准用于治疗预后不良的肾细胞癌二线药物，但其疗效相对有限，患者往往发展成对mTOR靶向治疗的抵抗。TFEB是近期发现的mTOR的一个重要底物，可被mTOR磷酸化142和211位丝氨酸而失活。TFEB在调控肿瘤发展、自噬、溶酶体生物合成以及细胞代谢中起重要作用。PD-L1是抑制CD8+T细胞肿瘤杀伤功能的重要共抑制配体，是肿瘤细胞免疫逃逸的一种重要机制。本论文探讨肾癌细胞对mTOR靶向抑制剂的抵抗机制，主要集中在研究转录因子TFEB和PD-L1在介导mTOR靶向抑制剂抵抗中的可能功能与机制。
方法：
(1)体外实验评价TFEB对肾癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响：在野生型肾癌细胞系中下调或过表达TFEB，CCK8和EdU参入实验检测肾癌细胞的增殖，流式检测AnnexinV-PI比较肾癌细胞的凋亡，Transwell检测肾癌细胞的迁移能力。
(2)体内模型中进一步研究TFEB在肾癌中的作用：筛选出稳定过表达组成性活化TFEB-S211A的小鼠Renca肾癌细胞系及其对照细胞：①接种BALB/cnude小鼠，构建皮下移植瘤模型，定期用游标卡尺测量瘤体体积；流式检测CD45-肿瘤细胞Ki67和AnnexinV/PI比例，评价在肿瘤细胞过表达TFEB是否影响Renca细胞在小鼠体内的增殖和凋亡。②接种野生型BALB/c小鼠，构建皮下移植瘤模型，定期用游标卡尺测量瘤体体积；组化检测肿瘤组织内瘤细胞TFEB和PD-L1蛋白表达水平；流式检测瘤内杀伤性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)功能因子CD107A、GZMB、IL-2、TNF-α和IFN-γ表达水平，以及NK细胞、TAMs和MDSCs的比例，比较野生型和TFEB-S211ARenca肿瘤内浸润免疫细胞差异。
(3)比较多种人肾透明细胞癌组织中TFEB与PD-L1蛋白水平，探讨肾癌细胞TFEB表达是否与PD-L1表达相关：免疫印迹和流式检测五株人肾癌细胞系TFEB和PD-L1蛋白水平及其相关性；组化比较PD-L1-和PD-L1+区域TFEB的免疫染色评分；分析PD-L1与肿瘤等级、分期之间是否具有相关性。
(4)探究RCC中TFEB对PD-L1的调控机制：在786-O细胞敲低TFEB，或在769-P细胞中过表达TFEB，qPCR和流式分别检测PD-L1mRNA和蛋白水平变化；联用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)和qPCR技术检测TFEB在PD-L1基因启动子上的结合情况；荧光素酶报告试剂盒检测TFEB过表达时PD-L1启动子的转录活性。
(5)体外研究mTOR抑制剂对肾癌细胞系TFEB和PD-L1的作用：肾癌细胞系786-O和769-P用mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1刺激后，免疫印迹和流式分别检测TFEB和PD-L1蛋白表达水平。
(6)阐明mTOR抑制剂上调肾癌细胞PD-L1表达的机制：使用mTOR抑制剂Torin-1刺激肾癌细胞系786-O和769-P细胞，联用染色质免疫共沉淀技术和qPCR技术检测TFEB在PD-L1基因启动子上的结合情况；mTOR抑制剂分别刺激WT和TFEB敲除的786-O细胞系，免疫印迹检测TFEB和PD-L1蛋白水平变化。
(7)探讨mTOR抑制剂对原代肾癌细胞TFEB和PD-L1的作用：从临床肾透明细胞癌组织中分离出原代肾癌细胞，通过免疫荧光实验检测细胞中CAIX阳性率来鉴定原代肾癌细胞的纯度；mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1刺激原代肾癌细胞，分别使用免疫印迹、流式和免疫荧光检测TFEB和PD-L1的变化趋势。
(8)评价mTOR抑制剂和anti-PD-L1联用对肾癌的疗效：皮下接种Renca肾癌细胞构建小鼠移植瘤模型，从接种后12天开始腹腔注射Temsirolimus和anti-PD-L1。游标卡尺测量瘤体体积；组化和流式检测肿瘤细胞Ki-67阳性率；免疫印迹和组化检测肿瘤细胞TFEB和PD-L1表达水平；流式检测瘤内CD8+T细胞CD107A和GZMB表达情况。
结果：
(1)体外实验发现，在786-O细胞中下调TFEB水平，或在769-P细胞中过表达TFEB，均不影响肾癌细胞系的增殖、凋亡和迁移能力。
(2)①在BALB/cnude小鼠中，WT和TFEB-S211ARenca肿瘤体积无显著差别，肿瘤细胞AnnexinV+以及Ki-67+比例无统计学差异；②在野生型BALB/c小鼠中，与WT组相比，接种TFEB-S211ARenca细胞后肿瘤体积明显增大；TFEB-S211ARenca肿瘤中瘤细胞TFEB和PD-L1蛋白水平显著上调。肿瘤浸润CTL中CD107a、GZMB、IL-2和TNF-α比例下调；NK、TAMs和MDSCs的比例无显著差异。
(3)在人肾癌细胞系中，TFEB和PD-L1蛋白水平呈正相关；临床肾透明细胞癌组织PD-L1+区域TFEB的免疫染色评分明显高于PD-L1-区域；PD-L1与肿瘤分级和分期呈正相关。
(4)在786-O细胞中下调TFEB，PD-L1mRNA和蛋白水平显著降低，TFEB在PD-L1基因启动子上的结合减少；反之，在769-P细胞中过表达TFEB，PD-L1mRNA和蛋白水平显著增加，TFEB在PD-L1基因启动子上的结合增多。
(5)mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1处理786-O和769-P细胞后，TFEB和PD-L1蛋白水平显著升高。
(6)用Torin-1刺激786-O和769-P肾癌细胞系，可显著上调TFEB在PD-L1基因启动子上的结合；在786-O细胞中敲低TFEB可显著阻断mTOR抑制剂对PD-L1的上调作用。
(7)mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1可在肿瘤病人原代肾癌细胞中活化TFEB，且呈时间依赖性，并能上调PD-L1蛋白表达。
(8)Temsirolimus和anti-PD-L1联合治疗能协同抑制肾癌肿瘤体积和抑制肿瘤细胞Ki-67+比例；TEM治疗可显著上调肾癌组织中肿瘤细胞的TFEB和PD-L1蛋白水平；联用TEM和anti-PD-L1可增强肿瘤浸润CD8+T细胞CD107a和GZMB的表达。
结论：
在不同的人肾癌细胞系和临床肾癌组织中，TFEB表达与PD-L1表达呈正相关；肿瘤细胞TFEB促进肿瘤生长依赖机体免疫系统；使用mTOR抑制剂能导致TFEB异位入核增多和结合PD-L1基因启动子诱导PD-L1表达，从而抑制CD8+T细胞的杀伤功能，进而介导肾癌细胞免疫逃逸和对mTOR抑制剂的抵抗。mTOR靶向抑制剂和PD-L1抗体联用能在小鼠模型中协同抑制肾癌生长。