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目的:
mTOR通路相关基因VHL、PTEN、TSC1、TSC2、FLCN和mTORC1等基因突变与肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的发生和发展相关。mTOR抑制剂依维莫司和替西罗莫司已被FDA批准用于治疗预后不良的肾细胞癌二线药物,但其疗效相对有限,患者往往发展成对mTOR靶向治疗的抵抗。TFEB是近期发现的mTOR的一个重要底物,可被mTOR磷酸化142和211位丝氨酸而失活。TFEB在调控肿瘤发展、自噬、溶酶体生物合成以及细胞代谢中起重要作用。PD-L1是抑制CD8+T细胞肿瘤杀伤功能的重要共抑制配体,是肿瘤细胞免疫逃逸的一种重要机制。本论文探讨肾癌细胞对mTOR靶向抑制剂的抵抗机制,主要集中在研究转录因子TFEB和PD-L1在介导mTOR靶向抑制剂抵抗中的可能功能与机制。
方法:
(1)体外实验评价TFEB对肾癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响:在野生型肾癌细胞系中下调或过表达TFEB,CCK8和EdU参入实验检测肾癌细胞的增殖,流式检测AnnexinV-PI比较肾癌细胞的凋亡,Transwell检测肾癌细胞的迁移能力。
(2)体内模型中进一步研究TFEB在肾癌中的作用:筛选出稳定过表达组成性活化TFEB-S211A的小鼠Renca肾癌细胞系及其对照细胞:①接种BALB/cnude小鼠,构建皮下移植瘤模型,定期用游标卡尺测量瘤体体积;流式检测CD45-肿瘤细胞Ki67和AnnexinV/PI比例,评价在肿瘤细胞过表达TFEB是否影响Renca细胞在小鼠体内的增殖和凋亡。②接种野生型BALB/c小鼠,构建皮下移植瘤模型,定期用游标卡尺测量瘤体体积;组化检测肿瘤组织内瘤细胞TFEB和PD-L1蛋白表达水平;流式检测瘤内杀伤性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)功能因子CD107A、GZMB、IL-2、TNF-α和IFN-γ表达水平,以及NK细胞、TAMs和MDSCs的比例,比较野生型和TFEB-S211ARenca肿瘤内浸润免疫细胞差异。
(3)比较多种人肾透明细胞癌组织中TFEB与PD-L1蛋白水平,探讨肾癌细胞TFEB表达是否与PD-L1表达相关:免疫印迹和流式检测五株人肾癌细胞系TFEB和PD-L1蛋白水平及其相关性;组化比较PD-L1-和PD-L1+区域TFEB的免疫染色评分;分析PD-L1与肿瘤等级、分期之间是否具有相关性。
(4)探究RCC中TFEB对PD-L1的调控机制:在786-O细胞敲低TFEB,或在769-P细胞中过表达TFEB,qPCR和流式分别检测PD-L1mRNA和蛋白水平变化;联用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)和qPCR技术检测TFEB在PD-L1基因启动子上的结合情况;荧光素酶报告试剂盒检测TFEB过表达时PD-L1启动子的转录活性。
(5)体外研究mTOR抑制剂对肾癌细胞系TFEB和PD-L1的作用:肾癌细胞系786-O和769-P用mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1刺激后,免疫印迹和流式分别检测TFEB和PD-L1蛋白表达水平。
(6)阐明mTOR抑制剂上调肾癌细胞PD-L1表达的机制:使用mTOR抑制剂Torin-1刺激肾癌细胞系786-O和769-P细胞,联用染色质免疫共沉淀技术和qPCR技术检测TFEB在PD-L1基因启动子上的结合情况;mTOR抑制剂分别刺激WT和TFEB敲除的786-O细胞系,免疫印迹检测TFEB和PD-L1蛋白水平变化。
(7)探讨mTOR抑制剂对原代肾癌细胞TFEB和PD-L1的作用:从临床肾透明细胞癌组织中分离出原代肾癌细胞,通过免疫荧光实验检测细胞中CAIX阳性率来鉴定原代肾癌细胞的纯度;mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1刺激原代肾癌细胞,分别使用免疫印迹、流式和免疫荧光检测TFEB和PD-L1的变化趋势。
(8)评价mTOR抑制剂和anti-PD-L1联用对肾癌的疗效:皮下接种Renca肾癌细胞构建小鼠移植瘤模型,从接种后12天开始腹腔注射Temsirolimus和anti-PD-L1。游标卡尺测量瘤体体积;组化和流式检测肿瘤细胞Ki-67阳性率;免疫印迹和组化检测肿瘤细胞TFEB和PD-L1表达水平;流式检测瘤内CD8+T细胞CD107A和GZMB表达情况。
结果:
(1)体外实验发现,在786-O细胞中下调TFEB水平,或在769-P细胞中过表达TFEB,均不影响肾癌细胞系的增殖、凋亡和迁移能力。
(2)①在BALB/cnude小鼠中,WT和TFEB-S211ARenca肿瘤体积无显著差别,肿瘤细胞AnnexinV+以及Ki-67+比例无统计学差异;②在野生型BALB/c小鼠中,与WT组相比,接种TFEB-S211ARenca细胞后肿瘤体积明显增大;TFEB-S211ARenca肿瘤中瘤细胞TFEB和PD-L1蛋白水平显著上调。肿瘤浸润CTL中CD107a、GZMB、IL-2和TNF-α比例下调;NK、TAMs和MDSCs的比例无显著差异。
(3)在人肾癌细胞系中,TFEB和PD-L1蛋白水平呈正相关;临床肾透明细胞癌组织PD-L1+区域TFEB的免疫染色评分明显高于PD-L1-区域;PD-L1与肿瘤分级和分期呈正相关。
(4)在786-O细胞中下调TFEB,PD-L1mRNA和蛋白水平显著降低,TFEB在PD-L1基因启动子上的结合减少;反之,在769-P细胞中过表达TFEB,PD-L1mRNA和蛋白水平显著增加,TFEB在PD-L1基因启动子上的结合增多。
(5)mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1处理786-O和769-P细胞后,TFEB和PD-L1蛋白水平显著升高。
(6)用Torin-1刺激786-O和769-P肾癌细胞系,可显著上调TFEB在PD-L1基因启动子上的结合;在786-O细胞中敲低TFEB可显著阻断mTOR抑制剂对PD-L1的上调作用。
(7)mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1可在肿瘤病人原代肾癌细胞中活化TFEB,且呈时间依赖性,并能上调PD-L1蛋白表达。
(8)Temsirolimus和anti-PD-L1联合治疗能协同抑制肾癌肿瘤体积和抑制肿瘤细胞Ki-67+比例;TEM治疗可显著上调肾癌组织中肿瘤细胞的TFEB和PD-L1蛋白水平;联用TEM和anti-PD-L1可增强肿瘤浸润CD8+T细胞CD107a和GZMB的表达。
结论:
在不同的人肾癌细胞系和临床肾癌组织中,TFEB表达与PD-L1表达呈正相关;肿瘤细胞TFEB促进肿瘤生长依赖机体免疫系统;使用mTOR抑制剂能导致TFEB异位入核增多和结合PD-L1基因启动子诱导PD-L1表达,从而抑制CD8+T细胞的杀伤功能,进而介导肾癌细胞免疫逃逸和对mTOR抑制剂的抵抗。mTOR靶向抑制剂和PD-L1抗体联用能在小鼠模型中协同抑制肾癌生长。
mTOR通路相关基因VHL、PTEN、TSC1、TSC2、FLCN和mTORC1等基因突变与肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的发生和发展相关。mTOR抑制剂依维莫司和替西罗莫司已被FDA批准用于治疗预后不良的肾细胞癌二线药物,但其疗效相对有限,患者往往发展成对mTOR靶向治疗的抵抗。TFEB是近期发现的mTOR的一个重要底物,可被mTOR磷酸化142和211位丝氨酸而失活。TFEB在调控肿瘤发展、自噬、溶酶体生物合成以及细胞代谢中起重要作用。PD-L1是抑制CD8+T细胞肿瘤杀伤功能的重要共抑制配体,是肿瘤细胞免疫逃逸的一种重要机制。本论文探讨肾癌细胞对mTOR靶向抑制剂的抵抗机制,主要集中在研究转录因子TFEB和PD-L1在介导mTOR靶向抑制剂抵抗中的可能功能与机制。
方法:
(1)体外实验评价TFEB对肾癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响:在野生型肾癌细胞系中下调或过表达TFEB,CCK8和EdU参入实验检测肾癌细胞的增殖,流式检测AnnexinV-PI比较肾癌细胞的凋亡,Transwell检测肾癌细胞的迁移能力。
(2)体内模型中进一步研究TFEB在肾癌中的作用:筛选出稳定过表达组成性活化TFEB-S211A的小鼠Renca肾癌细胞系及其对照细胞:①接种BALB/cnude小鼠,构建皮下移植瘤模型,定期用游标卡尺测量瘤体体积;流式检测CD45-肿瘤细胞Ki67和AnnexinV/PI比例,评价在肿瘤细胞过表达TFEB是否影响Renca细胞在小鼠体内的增殖和凋亡。②接种野生型BALB/c小鼠,构建皮下移植瘤模型,定期用游标卡尺测量瘤体体积;组化检测肿瘤组织内瘤细胞TFEB和PD-L1蛋白表达水平;流式检测瘤内杀伤性T细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)功能因子CD107A、GZMB、IL-2、TNF-α和IFN-γ表达水平,以及NK细胞、TAMs和MDSCs的比例,比较野生型和TFEB-S211ARenca肿瘤内浸润免疫细胞差异。
(3)比较多种人肾透明细胞癌组织中TFEB与PD-L1蛋白水平,探讨肾癌细胞TFEB表达是否与PD-L1表达相关:免疫印迹和流式检测五株人肾癌细胞系TFEB和PD-L1蛋白水平及其相关性;组化比较PD-L1-和PD-L1+区域TFEB的免疫染色评分;分析PD-L1与肿瘤等级、分期之间是否具有相关性。
(4)探究RCC中TFEB对PD-L1的调控机制:在786-O细胞敲低TFEB,或在769-P细胞中过表达TFEB,qPCR和流式分别检测PD-L1mRNA和蛋白水平变化;联用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)和qPCR技术检测TFEB在PD-L1基因启动子上的结合情况;荧光素酶报告试剂盒检测TFEB过表达时PD-L1启动子的转录活性。
(5)体外研究mTOR抑制剂对肾癌细胞系TFEB和PD-L1的作用:肾癌细胞系786-O和769-P用mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1刺激后,免疫印迹和流式分别检测TFEB和PD-L1蛋白表达水平。
(6)阐明mTOR抑制剂上调肾癌细胞PD-L1表达的机制:使用mTOR抑制剂Torin-1刺激肾癌细胞系786-O和769-P细胞,联用染色质免疫共沉淀技术和qPCR技术检测TFEB在PD-L1基因启动子上的结合情况;mTOR抑制剂分别刺激WT和TFEB敲除的786-O细胞系,免疫印迹检测TFEB和PD-L1蛋白水平变化。
(7)探讨mTOR抑制剂对原代肾癌细胞TFEB和PD-L1的作用:从临床肾透明细胞癌组织中分离出原代肾癌细胞,通过免疫荧光实验检测细胞中CAIX阳性率来鉴定原代肾癌细胞的纯度;mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1刺激原代肾癌细胞,分别使用免疫印迹、流式和免疫荧光检测TFEB和PD-L1的变化趋势。
(8)评价mTOR抑制剂和anti-PD-L1联用对肾癌的疗效:皮下接种Renca肾癌细胞构建小鼠移植瘤模型,从接种后12天开始腹腔注射Temsirolimus和anti-PD-L1。游标卡尺测量瘤体体积;组化和流式检测肿瘤细胞Ki-67阳性率;免疫印迹和组化检测肿瘤细胞TFEB和PD-L1表达水平;流式检测瘤内CD8+T细胞CD107A和GZMB表达情况。
结果:
(1)体外实验发现,在786-O细胞中下调TFEB水平,或在769-P细胞中过表达TFEB,均不影响肾癌细胞系的增殖、凋亡和迁移能力。
(2)①在BALB/cnude小鼠中,WT和TFEB-S211ARenca肿瘤体积无显著差别,肿瘤细胞AnnexinV+以及Ki-67+比例无统计学差异;②在野生型BALB/c小鼠中,与WT组相比,接种TFEB-S211ARenca细胞后肿瘤体积明显增大;TFEB-S211ARenca肿瘤中瘤细胞TFEB和PD-L1蛋白水平显著上调。肿瘤浸润CTL中CD107a、GZMB、IL-2和TNF-α比例下调;NK、TAMs和MDSCs的比例无显著差异。
(3)在人肾癌细胞系中,TFEB和PD-L1蛋白水平呈正相关;临床肾透明细胞癌组织PD-L1+区域TFEB的免疫染色评分明显高于PD-L1-区域;PD-L1与肿瘤分级和分期呈正相关。
(4)在786-O细胞中下调TFEB,PD-L1mRNA和蛋白水平显著降低,TFEB在PD-L1基因启动子上的结合减少;反之,在769-P细胞中过表达TFEB,PD-L1mRNA和蛋白水平显著增加,TFEB在PD-L1基因启动子上的结合增多。
(5)mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1处理786-O和769-P细胞后,TFEB和PD-L1蛋白水平显著升高。
(6)用Torin-1刺激786-O和769-P肾癌细胞系,可显著上调TFEB在PD-L1基因启动子上的结合;在786-O细胞中敲低TFEB可显著阻断mTOR抑制剂对PD-L1的上调作用。
(7)mTOR抑制剂rapamycin和Torin-1可在肿瘤病人原代肾癌细胞中活化TFEB,且呈时间依赖性,并能上调PD-L1蛋白表达。
(8)Temsirolimus和anti-PD-L1联合治疗能协同抑制肾癌肿瘤体积和抑制肿瘤细胞Ki-67+比例;TEM治疗可显著上调肾癌组织中肿瘤细胞的TFEB和PD-L1蛋白水平;联用TEM和anti-PD-L1可增强肿瘤浸润CD8+T细胞CD107a和GZMB的表达。
结论:
在不同的人肾癌细胞系和临床肾癌组织中,TFEB表达与PD-L1表达呈正相关;肿瘤细胞TFEB促进肿瘤生长依赖机体免疫系统;使用mTOR抑制剂能导致TFEB异位入核增多和结合PD-L1基因启动子诱导PD-L1表达,从而抑制CD8+T细胞的杀伤功能,进而介导肾癌细胞免疫逃逸和对mTOR抑制剂的抵抗。mTOR靶向抑制剂和PD-L1抗体联用能在小鼠模型中协同抑制肾癌生长。