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研究背景:血管中膜钙化是糖尿病(diabetic mellitus,DM)常见的病理现象之一,与糖尿病心血管事件的发生密切相关。糖尿病状态下,糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)的生成增加,后者可通过氧化应激、炎症因子等机制诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)骨型转化,被认为是血管中膜钙化的主要细胞机制。近年来,间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)及其外泌体在心血管疾病的治疗方面取得了重大进展。外泌体被认为是细胞间通讯的重要载体,在不同干预条件下,外泌体内容物的表达谱产生一定的变化,是可调控的非细胞依赖性药物载体。研究表明,AGEs可抑制MSC骨型转化,提示AGEs预处理的MSC外泌体中可能携带成骨抑制因子,并有望成为糖尿病血管钙化的新治疗靶点。microRNA-146a(miR-146a)是重要的炎症及氧化应激调节因子,血浆及组织miR-146a的表达减少与糖尿病的多种并发症密切相关。AGEs可上调巨噬细胞miR-146a表达,而MSCs中miR-146a的过表达则与其成骨抑制相关,提示miR-146a可能参与了 AGEs诱导的MSCs成骨抑制。miRDB数据库预测氧化应激诱导剂硫氧还原蛋白互作蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是 miR-146a 的潜在靶基因,提示miR-146a可能是AGEs/氧化应激/骨型转化信号通路的中间因子。综合以上研究背景,本研究提出如下假说:1、miR-146a是具有抑制骨型转化作用的生物分子。2、AGEs-BSA上调MSCs成骨抑制因子miR-146a的表达,后者可以外泌体形式穿梭进入VSMC中,发挥抑制VSMC钙化的保护作用。3、miR-146a通过TXNIP/ROS通路抑制VSMCs骨型转化。研究方法:1.分离培养原代SD大鼠VSMC及MSC,超速离心法收集MSC外泌体,透射电镜观察外泌体形态特征,Western blot检测外泌体标记蛋白CD9、Alix及Tsg101的表达,纳米颗粒跟踪分析仪(Nanosight Analysis,NTA)分析外泌体粒径大小及分布。2.50-200μg/mL的AGEs-BSA干预VSMC细胞0-48小时,CCK-8检测细胞活力变化;RT-PCR检测 Runx2、BMP-2、miRNA-146a、TXNIP的mRNA表达;Western blot检测Runx2、BMP-2、TXNIP蛋白表达;ROS探针检测细胞内ROS水平;MDA浓度检测试剂盒检测VSMC中MDA浓度;SOD活性检测试剂盒检测细胞内SOD活性;3.MSCs在含或不含200 μg/mL的AGEs-BSA的无血清培养基中培养48小时,分别收集干预组和未干预组的MSC条件培养基(condition medium,CM),记为:MSC/CM,A-MSC/CM;超速离心法收集两组MSC外泌体(exosome,exo),记为:MSC/exo,A-MSC/exo;离心后不含外泌体的上清分别记为:MSC/CM(-exo),A-MSC/CM(-exo)。RT-PCR检测上述条件培养基及外泌体中miR-146a 水平;VSMCs分别培养在:1.Control组:200 μg/mL BSA;2.AGEs-BSA组:200 μg/mL AGEs-BSA;3.AGEs-BSA+MSC/CM 组;4.AGEs-BSA+ AGEs-MSC/CM 组;5.AGEs-BSA+M SC/exo组;6.AGEs-BSA+A-MSC/exo组;7.AGEs-BSA+MSC/CM(-exo)组;8.AGEs-BSA+A-MSC/CM(-exo)组 RT-PCR 检测 Runx2、BMP-2、miR-146a mRNA表达;Western blot检测 Runx2、BMP-2蛋白表达;4.构建miR-146a过表达的MSC细胞系(146a/MSC),以转染无义对照(none target control,NTC)质粒的MSC(NTC/MSC)作为对照。在含或不含GW4869的培养基中预处理12h 后,分别与VSMCs进行非接触式共培养,同时在共培养体系中加入200 μg/mLAGEs-BSA诱导VSMC骨型转化。RT-PCR检测骨型转化标志物Runx2及BMP-2及miR-146a mRNA表达;Western blot检测骨型转化标志物Runx2及BMP-2蛋白表达。5.分离纯化miR-146a过表达的MSC外泌体;VSMCs分别培养在1.Control组:2000μg/mLBSA;2.AGEs-BSA组:200 μg/mLAGEs-BSA;3.AGEs-BSA+β-GP组:2000μg/mLAGEs-BSA+10mmol/Lβ-GP;4.AGEs-BSA+β-GP+146a/exo组:200μg/mLAGEs-BSA+10mmol/Lβ-GP+ 146a/exo(5、10、20μmL);干预30 min后、,ROS探针检测细胞内ROS水平,MDA浓度检测试剂盒检测VSMC中MDA浓度,SOD检测细胞内SOD活性;48 h,RT-PCR检测 VSMCs中 Runx2、BMP-2、miR-146a、TXNIP的mRNA表达,Western blot检测 Runx2、BMP-2、TXNIP蛋白表达;7天,ALP检测试剂盒检测细胞内ALP活性;21天,茜素红染色检测细胞内钙离子沉积。6.构建TXNIP过表达的VSMC细胞系(TXNIP/VSMC),以转染无义质粒的VSMC(NTC/VSMC)作为对照。两者分别接受如下干预:1.200 μg/mLBSA;2.200μg/mLAGEs-BSA;3.AGEs-BSA+146a/exo,ROS探针检测细胞内ROS水平,MDA浓度检测试剂盒检测VSMC中MDA浓度,SOD检测细胞内SOD活性,RT-PCR检测VSMC中Runx2、BMP-2、miR-146a、TXNIP的mRNA表达,Western blot检测Runx2、BM P-2、TXNIP蛋白表达。7.荧光素酶报告基因检测miR-146a与TXNIP3’UTR区的相互作用。研究结果:1.原代SD大鼠VSMC α-SMA及SM22α表达阳性率>95%;原代SD大鼠MSC CD34及CD45表达率<5%,CD73及CD90阳性率>95%。电镜观察MSC外泌体呈球形,WB检测外泌体标记蛋白CD9、Alix及Tsg101表达阳性,Nanosight分析结果显示待测囊泡粒径位于50-200nm之间。2.50-200 μg/mL AGEs-BSA干预VSMC 0-48h对细胞活力无明显影响;AGEs-BSA浓度依赖性增加Runx2、BMP-2及TXNIP mRNA和蛋白表达,下调miR-146a表达;AGEs-BSA组VSMC内ROS水平、MDA含量较对照组增加,SOD活性较对照组降低。3.A-MSC/CM,A-MSC/exo中miR-146a的含量高于其他各组条件培养基及外泌体;与对照组相比,AGEs-BSA组Runx2、BMP-2、TXNIP mRNA及蛋白表达增高,miR-146a 的表达降低;与 AGEs-BSA 组相比,AGEs-BSA+A-MSC/CM,AGEs-BSA+A-MSC/exo组中Runx2、BMP-2及TXNIP mRNA及蛋白的表达降低,miR-146a 表达增加;与 AGEs-BSA 组相比,AGEs-BSA+MSC/CM,AGEs-BSA+M SC/exo,AGEs-BSA+M SC/CM(-exo),AGEs-BSA+A-M SC/CM(-exo)组Runx2、BMP-2、TXNIP及miR-146a的表达无明显变化。4.NTC/MSC共培养组相比,与146a/MSC共培养的VSMC中miR-146a含量增加,Runx2、BMP-2及TXNIP mRNA及蛋白的表达降低;GW4869预处理的146a/MSC对VSMC上述各指标的作用消失。5.与对照组相比,AGEs-BSA组VSMC中Runx2、BMP-2及TXNIP mRNA及蛋白的表达增高,miR-146a的表达降低;细胞内ROS水平及MDA浓度增加,SOD活性降低;细胞内ALP活性增加,茜素红染色较对照组颜色加深。与AGEs-BSA组相比,β-GP+AGEs-BSA组Runx2、BMP-2及TXNIPmRNA及蛋白的表达进一步增高,miR-146a的表达降低;细胞内ROS水平及MDA浓度增加,SOD活性降低;细胞内ALP活性增加,茜素红染色颜色加深。146a/exo剂量依赖性降低β-GP+AGEs-BSA组VSMC Runx2、BMP-2及TXNIP mRNA及蛋白的表达;降低细胞内ROS水平及MDA浓度;上调SOD活性;抑制ALP活性;茜素红染色显示细胞内钙结节形成减少。6.与NTC/VSMC相比,TXNIP/VSMC 细胞中Runx2、BMP-2及TXNIP mRNA和蛋白的表达增加,miR-146a表达降低,细胞内ROS水平及MDA浓度增加,SOD活性降低;146a/exo对TXNIP/VSMC的上述各指标无明显影响。7.野生型TXNIP-3’UTR区表达质粒及miR-146amimic共转染的细胞中荧光强度明显降低。结论本研究结果提示:,miR-146a是VSMC骨型转化的抑制因子,AGEs-BSA预处理的MSC及146a/MSC中miR-146a表达增加,后者以外泌体的形式穿梭至VSMC中,通过抑制TXNIP/氧化应激信号通路,减轻糖基化终产物诱导的VSMC钙化。因此,MSC外泌体可有效传递miR-146a至VSMC,抑制VSMC成骨分化,为血管钙化的生物治疗提供了新的思路和方法。