菲律宾蛤仔高通量转录组分析及生长相关基因的克隆与表达研究

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhang1xiao123321
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菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum),一是以来都被我国沿海地区作为主要的水产养殖对象[1]。经济贝类生长相关经济指标一直以来都被作为选择育种的一种重要评判标准,对贝类的遗传育种研究工作有着非凡意义。近年来,由于菲律宾蛤仔人工育种技术和批量化种苗繁育技术的进一步便捷高效,从而使得菲律宾蛤仔的养殖业迅猛发展,进一步推动了海洋贝类养殖业的经济发展和社会效益。然而,与成熟的人工育种技术相不匹配的是,目前菲律宾蛤仔生长相关的分子遗传研究和功能基因开发等分子层面研究才刚刚起步,使得分子遗传育种与人工繁育工作不能同步高效开展。为了更好的解决这一问题,近年来针对菲律宾蛤仔生长相关的功能基因的研究仅仅是刚刚起步阶段,仅有的一些权威实验报道也大多集中针对免疫相关基因的研究进展上,而关于菲律宾蛤仔生长相关的功能基因的研究就更加少之又少,仅在合浦珠母贝、棘牡蛎和太平洋牡蛎等贝雷中有少量相关报导[2-3]。通过序列比对发现,菲律宾蛤仔mstn基因与缢蛏当中的mstn基因的同源性可以高达90%以上,与瘤背石璜的同源性达到84%。说明该基因在生长调控当中所发挥的功能与脊椎动物中较为接近。将mstn基因经过Blast及蛋白功能域查找,依据系统进化树的结构可以看出,菲律宾蛤仔与缢蛏单独聚为一支,然后再与紫扇贝和脊椎动物聚在一起,与凡纳滨对虾和海湾扇贝相比,更加接近脊椎动物的mstn基因。主要结果和结论如下:
  1.本研究利用高通量测序技术分析了菲律宾蛤仔同一时期生长快(RpF)和生长慢(RpS )两组蛤仔样本的差异基因。测序结果显示,本次测得共计392,708,414rawreads,过滤后得456,080,4cleanreads,被注释在7大数据库当中。在测序后所得到的不同差异基因中查阅文献筛选出35个与生长直接相关的重要功能基因进行荧光定量PCR验证。依据转录组测序数据库注释的基因中鉴别出大量调控菲律宾蛤仔肌肉细胞、神经细胞、组织分化等的生长因子及受体(megf、igf、tuba、mitf、mstn等);由生长相关通路中筛选出与生长分化、组织发育等菲律宾蛤仔生长相关的候选基因,这为后续进行沿海地区经济贝类快速生长功能基因的研究和分子层面菲律宾蛤仔快速生长品系的良种选育工作提供了理论基础。
  2.通过筛选和实验验证,我们锁定了与菲律宾蛤仔快速生长发育经济指标直接相关的重要基因,并对其展开深入研究。首先应用RACE克隆技术获得了肌肉生长抑制素基因(myostation)基因的cDNA,得到其全长为2552bp。得到全长后紧接着利用RT-PCR技术针对菲律宾蛤仔成贝的不同组织中研究mstn基因有哪些表达特点,结果显示,mstn基因在菲律宾蛤仔的不同发育时期的表达量均有很大差异,RT-PCR结果显示,mstn基因在成贝性腺和闭壳肌中表达量较高;在不同生长发育阶段中,mstn基因在匍匐幼虫期的表达量显著较高于壳顶幼虫。以及担轮幼虫中表达量较高,推测mstn基因可能对蛤仔生长发育中多种组织的形成均有不同程度的影响,并积极参与蛤仔生长发育阶段的组织分化、调控胚胎生长发育等生理阶段。
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